艷山姜揮發(fā)油調(diào)控p62/Keap1/Nrf2信號(hào)改善糖尿病小鼠胰腺損傷

楊 紅，陳婷婷，陳永鑫，宋曉妹，馬 曉，張 寶，沈祥春，李 悅

(1. 貴陽市婦幼保健院(貴陽市兒童醫(yī)院)藥學(xué)部，貴州 貴陽 550003；2.天然藥物藥資源優(yōu)效利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550025，3.貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，貴州 貴陽 550025)

糖尿病已成為全世界發(fā)病率最高、死亡率最高的疾病之一，是威脅人類健康的重大衛(wèi)生問題。國際糖尿病聯(lián)盟2020年最新統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明：目前全世界至少有4.63億成人患有糖尿病，糖尿病及其并發(fā)癥已經(jīng)成為21世紀(jì)全球醫(yī)療衛(wèi)生的沉重負(fù)擔(dān)，是目前亟待解決的重大科學(xué)及社會(huì)民生焦點(diǎn)問題[1]。其中2型糖尿病(diabetes mellitus type 2，T2DM)所占比例達(dá)到93.7%[2]。T2DM的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，包括惡性高血糖、胰島素抵抗、胰島素分泌障礙和β細(xì)胞凋亡。以上情況的發(fā)生可使糖尿病持續(xù)惡化至無法逆轉(zhuǎn)，最終導(dǎo)致多系統(tǒng)組織器官功能障礙，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量和壽命[3]。臨床上針對(duì)T2DM的治療方式主要為采用外源性胰島素注射或口服降糖藥[4]，但二者應(yīng)用中易出現(xiàn)低血糖及注射部位肌肉萎縮等副作用現(xiàn)象，且大部分降糖藥物均是使得胰腺組織代償性的分泌胰島素以降低血糖，并非改善受損的胰腺功能[5]。因此，積極探索和尋找T2DM的病理生理新機(jī)制，尋找改善胰腺功能的關(guān)鍵靶位及防治藥物，對(duì)改善患者生活質(zhì)量具有重大意義。

氧化應(yīng)激在糖尿病進(jìn)程中發(fā)揮著重要作用，糖尿病長期存在的高血糖，可打破體內(nèi)氧化還原平衡，繼而引發(fā)組織器官損傷，加快糖尿病疾病的進(jìn)展。p62/Keap1/Nrf2信號(hào)通路在細(xì)胞抗氧化和外源性有毒物質(zhì)誘導(dǎo)的主要防御機(jī)制中發(fā)揮著極其重要的作用[6]。既往研究[7]顯示，Keap1-Nrf2信號(hào)通路的紊亂是胰腺功能障礙的驅(qū)動(dòng)力，重新激活Nrf2可有效減輕組織損傷、恢復(fù)組織的功能，對(duì)糖尿病的預(yù)防和治療具有重要意義。

民族藥艷山姜為姜科山姜屬植物Alpiniazerumbet(Pers.) Burttet Smith，前期研究表明，艷山姜的主要有效成分為揮發(fā)油(essential oils fromFructusAlpiniaezerumbet，EOFAZ)，具有廣泛的抗炎、抗氧化以及防治心血管系統(tǒng)疾病等多方面的生物活性[8]。最近課題組研究提示，EOFAZ可明顯改善糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)生發(fā)展[9]，但其對(duì)糖尿病應(yīng)激下胰腺組織損傷的作用以及作用機(jī)制尚不明確，故本研究探討其對(duì)糖尿病誘導(dǎo)的小鼠胰腺組織損傷的干預(yù)作用，明確其可能的作用靶點(diǎn)及途徑。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物60只♂ C57BL/6小鼠購自貴州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(黔20180001)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(黔20180001)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)得到貴州醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(No 2000499)。小鼠飼養(yǎng)在貴州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心，室溫保持在20～23 ℃，相對(duì)濕度保持在40%～70%。

1.2 藥物及試劑于貴州省貞豐縣采摘的艷山姜果實(shí)，經(jīng)貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)與藥用植物學(xué)教研室龍慶德副教授鑒定為姜科植物AlpiniazerumbetPers. Burttet Smith的干燥成熟果實(shí)(憑證標(biāo)本號(hào)：No 20151018)，按2015年版《中國藥典》(四部)通則2204揮發(fā)油測定法提取EOFAZ。收得率為1.3%。取EOFAZ，將其溶于吐溫80及甘油溶液(二者分別所占總體積的10%)中，使用生理鹽水補(bǔ)充體積。鹽酸二甲雙胍片購自于中美上海施貴寶制藥有限公司，批號(hào)：ABV4533。鏈脲佐菌素購自于美國Sigma公司，批號(hào)：HMBF 4669V。p62(18420-1-AP)，Keap1(10503-2-AP)，Nrf2(16396-1-AP)，HO-1(27282-1-AP)，Bax(50599-2-Ig)，Bcl-2(12789-1-AP)，β-actin(66009-1-Ig)一抗購自Proteintech公司。

1.3 主要儀器700-SERIES超低溫冰箱(Thermo 公司)，3020-426多功能全波長酶標(biāo)儀(Thermo公司)，奧林巴斯熒光顯微鏡TS100(日本)，CFX型凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)，SIM-F140AY65型制冰機(jī)(日本SANYO電子有限責(zé)任公司)，自動(dòng)生化儀(德國拜耳西門子公司)，5810R型冷凍離心機(jī)(德國Eppendorf公司)。

2 方法

2.1 動(dòng)物模型的建立C57BL/6小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，尾靜脈取血、血糖儀測定小鼠空腹血糖(fasting blood glucose，F(xiàn)BG)，F(xiàn)BG<11.1 mmol·L-1的小鼠隨機(jī)分為為正常對(duì)照組(n=20)、糖尿病造模組(n=40)。正常對(duì)照組小鼠給予基礎(chǔ)飼料、糖尿病造模組小鼠給予高脂高糖飼料HFS飼養(yǎng)2個(gè)月后，過夜禁食12 h，尾靜脈取血(50～100 μL)，測定血清空腹胰島素及血糖水平，采用穩(wěn)態(tài)模型(HOMA)評(píng)價(jià)胰島素抵抗(insulin resistance，IR)，當(dāng)HFS組的HOMA-IR>對(duì)照組即認(rèn)為胰島素抵抗形成，對(duì)產(chǎn)生胰島素抵抗的小鼠腹腔注射STZ(120 mg·kg-1)，正常對(duì)照組注射相同體積的枸櫞酸鈉緩沖液，72 h后測定血糖，F(xiàn)BG≥11.1 mmol·L-1的小鼠即被認(rèn)為實(shí)驗(yàn)性2型糖尿病(T2DM)模型建立成功。

2.2 分組、干預(yù)、取材將正常對(duì)照組小鼠隨機(jī)分為正常組(Control)和EOFAZ毒性組(180 mg·kg-1)，T2DM小鼠隨機(jī)分配為糖尿病組(DM)、EOFAZ低劑量組(90 mg·kg-1)、高劑量組(180 mg·kg-1)、二甲雙胍組(250 mg·kg-1)，每組均保留10只。EOFAZ組、二甲雙胍組分別灌胃EOFAZ和二甲雙胍的同時(shí)，正常組和DM組以等體積生理鹽水灌胃，每天一次。連續(xù)灌胃8周后處死小鼠，采血并取胰腺組織。

2.3 HE染色觀察胰腺組織的病理性變化切除部分胰腺泡于4%的多聚甲醛中，用于HE染色。石蠟包埋、切片、二甲苯脫蠟、梯度酒精(酒精濃度為100% Ⅰ，100% Ⅱ，95% Ⅰ，95% Ⅱ，80%，75%，三蒸水)脫水，然后用蘇木精染液染15 min，1%鹽酸酒精溶液分化5 s，碳酸鋰溶液藍(lán)化5 s，2%伊紅染液染色3 min，梯度酒精(酒精濃度分別為70%，80%，95% Ⅰ，95% Ⅱ，100% Ⅰ，100% Ⅱ)脫水。二甲苯溶液透明(切片于二甲苯Ⅰ中浸泡5 min，于二甲苯Ⅱ中浸泡5 min)，中性樹膠封片，于顯微鏡下采集照片(400×)。

2.4 免疫印跡分析切除部分胰腺凍存于-80 ℃，取胰腺組織30 mg，加入4倍體積RIPA與PMSF(二者比例為99 ∶1)，勻漿后12 000 r·min-1的轉(zhuǎn)速離心20 min，取上清，BCA蛋白定量試劑盒對(duì)蛋白進(jìn)行定量，用濃度為12%的SDS-PAGE凝膠試劑盒將蛋白樣品(30 μg)進(jìn)行電泳分離并將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜。5% BSA溶液封閉2 h后與p62(1 ∶2 000)，Keap1(1 ∶1 000)，Nrf2(1 ∶2 000)、HO-1(1 ∶1 000)、Bax(1 ∶2 000)、Bcl-2(1 ∶1 000)一抗在4 ℃下過夜孵育。次日，膜用1× TBST洗3次后與二抗室溫孵育1 h。膜洗3次后，用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行顯色，用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行曝光，用Image-Lab軟件對(duì)數(shù)字圖像進(jìn)行量化。

2.5 免疫組織化學(xué)切除部分胰腺固定于4%的多聚甲醛中，采用的是PV6000 Two-Step IHC Detection Reagent二步法檢測組織抗原表達(dá)。石蠟包埋、切片脫蠟、水化，3%過氧化氫室溫孵育10 min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性，抗原修復(fù)，Nrf2(1 ∶200)一抗，在4 ℃下過夜孵育，孵育二抗后加入DAB染色液顯色，蘇木精復(fù)染后脫水，中性樹脂封片。于顯微鏡下采集照片(400×)。

3 結(jié)果

3.1 EOFAZ對(duì)小鼠空腹血糖的影響與正常組相比，小鼠經(jīng)STZ誘導(dǎo)后空腹血糖(FBG)明顯升高，與DM組小鼠相比較，二甲雙胍組小鼠FBG水平明顯降低，EOFAZ對(duì)血糖無明顯影響(Fig 1)。

Fig 1 Effects of EOFAZ on FBG level in

3.2 EOFAZ對(duì)T2DM小鼠胰腺組織病理形態(tài)的影響HE染色結(jié)果表明，正常組的小鼠胰腺組織較為完整，胰島結(jié)構(gòu)豐富飽滿，具有完整的β細(xì)胞，排列緊密，胰島與外分泌腺界限清楚。DM組小鼠的胰島結(jié)構(gòu)不完整，邊界不均勻，模糊，內(nèi)有空泡浸潤。給予EOFAZ后可減輕胰腺組織的病理形態(tài)，表現(xiàn)為胰島組織完整，胰島中β細(xì)胞排列緊密(Fig 2)。

Fig 2 Effects of EOFAZ on pathological observation of pancreatic tissues in mice(HE×400)

Fig 3 Effects of EOFAZ on expression of p62，Keap1，Nfr2 and Ho-1 in

3.3 EOFAZ對(duì)小鼠胰腺組織p62，Keap1，Nrf2 及Ho-1蛋白表達(dá)的影響與正常組相比較，DM組小鼠胰腺組織中Keap1蛋白表達(dá)明顯增加，Nrf2、Ho-1、p62蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)。給予EOFAZ后，與DM組相比較，可明顯下調(diào)Keap1蛋白表達(dá)并上調(diào)Nrf2、Ho-1、p62蛋白表達(dá)(Fig 3)。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，與正常組小鼠胰腺組織相比較，胰腺組織中Nrf2蛋白表達(dá)降低。給予EOFAZ后，可明顯上調(diào)Nrf2的表達(dá)(Fig 4)。

Fig 4 Effects of EOFAZ on expression of Nrf2 in pancreatic tissues (400×)

3.4 EOFAZ對(duì)小鼠胰腺組織凋亡信號(hào)Bax，Bcl-2蛋白表達(dá)的影響與正常組相比較，DM組小鼠胰腺組織中Bax蛋白表達(dá)明顯增加，Bcl-2蛋白表達(dá)明顯降低。給予EOFAZ后，與DM組相比較，可明顯下調(diào)Bax蛋白表達(dá)并上調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)(Fig 5)。

Fig 5 Effects of EOFAZ on expression of Bax and Bcl-2 in pancreatic tissues

4 討論

糖尿病是一類由于胰島素分泌缺陷及(或)其生物作用障礙而引起的，以慢性高血糖為主要特征的臨床綜合征[10]。糖尿病主要分為1型糖尿病(diabetes mellitus type 1，T1DM)和2型糖尿病(diabetes mellitus type 2，T2DM)，T1DM的特點(diǎn)是機(jī)體胰島功能完全喪失，T2DM的主要特點(diǎn)是由于胰島細(xì)胞胰島素分泌不足或是機(jī)體產(chǎn)生胰島素抵抗導(dǎo)致無法控制升高的血糖，使糖尿病持續(xù)惡化至無法逆轉(zhuǎn)。長期存在的高血糖可誘導(dǎo)組織臟器功能損傷，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量和壽命，給家庭及社會(huì)帶來沉重的負(fù)擔(dān)[11]。中藥在治療流行性疾病如心血管疾病和糖尿病等已取得較為可觀的結(jié)果[12]。民族藥艷山姜為姜科山姜屬植物Alpiniazerumbet(Pers.) Burttet Smith，已被收錄于2003版《貴州省中藥、民族藥標(biāo)準(zhǔn)》。課題組前期研究顯示，艷山姜的主要有效成分為揮發(fā)油(EOFAZ)，具有抗炎、抗氧化應(yīng)激等生物活性。最新研究顯示EOFAZ對(duì)糖尿病視網(wǎng)膜病變具有明顯的改善作用。提示EOFAZ對(duì)糖尿病并發(fā)癥具有明顯的改善作用[9]。在本研究中，高糖高脂飼料飼養(yǎng)小鼠產(chǎn)生胰島素抵抗后，通過腹腔注射STZ成功建立T2DM小鼠模型。小鼠胰腺HE染色病理性觀察結(jié)果表明，EOFAZ可明顯改善糖尿病誘導(dǎo)的胰腺組織損傷。

隨著對(duì)T2DM的不斷深入研究，發(fā)現(xiàn)高血糖應(yīng)激狀態(tài)下，可導(dǎo)致胰腺組織氧化與抗氧化系統(tǒng)失衡。高血糖誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷及胰島β細(xì)胞凋亡是T2DM發(fā)生發(fā)展的最關(guān)鍵因素[13]。因此，尋找能有效改善胰腺氧化應(yīng)激損傷的藥物尤為迫切。核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor -E2-related factor 2，Nrf2)是廣為人知的抗氧化防御的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。正常生理狀態(tài)下，Nrf2由Keap1錨定，并在泛素化后被26S蛋白酶體快速降解，從而維持Nrf2在胞質(zhì)-胞核中的表達(dá)平衡[14]，當(dāng)機(jī)體氧化還原系統(tǒng)作用失衡發(fā)生氧化應(yīng)激損傷時(shí)，Nrf2與Keap1解離后可由胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到胞核，激活抗氧化基因如血紅素加氧酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)等的表達(dá)[15]，從而發(fā)揮抗氧化作用，保護(hù)胰腺組織。p62是自噬常見的生物標(biāo)志物之一，參與細(xì)胞內(nèi)溶酶體的運(yùn)輸和蛋白酶體降解泛素化過程，是Keap1/Nrf2通路上游重要的調(diào)控因子。p62蛋白表達(dá)上調(diào)可競爭性結(jié)合Keap1，抑制Nrf2泛素化，維持胞質(zhì)胞核中Nrf2水平的穩(wěn)定，從而誘導(dǎo)下游抗氧化基因的表達(dá)[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，給予EOFAZ后，可明顯上調(diào)p62的表達(dá)，抑制Nrf2的降解，降低Keap1蛋白表達(dá)，促進(jìn)下游抗氧化基因HO-1的轉(zhuǎn)錄，從而發(fā)揮抗氧化應(yīng)激的作用。

胰腺組織損傷是導(dǎo)致β細(xì)胞功能障礙直至凋亡的關(guān)鍵因素。β細(xì)胞作為分泌胰島素調(diào)節(jié)血糖的重要細(xì)胞，對(duì)氧化應(yīng)激損傷高度敏感。Bcl-2家族由抗凋亡蛋白(Bcl-2)和促凋亡蛋白(Bax)組成。氧化應(yīng)激損傷發(fā)生時(shí)，促凋亡蛋白表達(dá)(如Bax)異常上調(diào)、抗凋亡蛋白(如Bcl-2)異常下調(diào)后可激活凋亡信號(hào)通路，從而誘發(fā)β細(xì)胞凋亡[17]。本研究結(jié)果表明，EOFAZ可明顯下調(diào)DM小鼠胰腺組織中Bax的表達(dá)，上調(diào)Bcl-2的表達(dá)。

綜上所述，EOFAZ對(duì)DM誘導(dǎo)的胰腺組織損傷具有明顯改善作用，其作用與活化p62/Keap1/Nrf2信號(hào)并促進(jìn)其下游抗氧化基因表達(dá)，從而抑制凋亡相關(guān)，本研究為后期更進(jìn)一步研究EOFAZ改善胰腺組織損傷，恢復(fù)胰腺功能提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。為民族藥艷山姜防治糖尿病開拓新的理論指導(dǎo)與實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，對(duì)促進(jìn)民族藥研究的現(xiàn)代化具有重要的社會(huì)意義。