艷山姜揮發油調控p62/Keap1/Nrf2信號改善糖尿病小鼠胰腺損傷

楊 紅，陳婷婷，陳永鑫，宋曉妹，馬 曉，張 寶，沈祥春，李 悅

(1. 貴陽市婦幼保健院(貴陽市兒童醫院)藥學部，貴州 貴陽 550003；2.天然藥物藥資源優效利用重點實驗室，貴州 貴陽 550025，3.貴州醫科大學藥學院，貴州 貴陽 550025)

糖尿病已成為全世界發病率最高、死亡率最高的疾病之一，是威脅人類健康的重大衛生問題。國際糖尿病聯盟2020年最新統計數據表明：目前全世界至少有4.63億成人患有糖尿病，糖尿病及其并發癥已經成為21世紀全球醫療衛生的沉重負擔，是目前亟待解決的重大科學及社會民生焦點問題[1]。其中2型糖尿病(diabetes mellitus type 2，T2DM)所占比例達到93.7%[2]。T2DM的發病機制復雜，包括惡性高血糖、胰島素抵抗、胰島素分泌障礙和β細胞凋亡。以上情況的發生可使糖尿病持續惡化至無法逆轉，最終導致多系統組織器官功能障礙，嚴重影響患者生活質量和壽命[3]。臨床上針對T2DM的治療方式主要為采用外源性胰島素注射或口服降糖藥[4]，但二者應用中易出現低血糖及注射部位肌肉萎縮等副作用現象，且大部分降糖藥物均是使得胰腺組織代償性的分泌胰島素以降低血糖，并非改善受損的胰腺功能[5]。因此，積極探索和尋找T2DM的病理生理新機制，尋找改善胰腺功能的關鍵靶位及防治藥物，對改善患者生活質量具有重大意義。

氧化應激在糖尿病進程中發揮著重要作用，糖尿病長期存在的高血糖，可打破體內氧化還原平衡，繼而引發組織器官損傷，加快糖尿病疾病的進展。p62/Keap1/Nrf2信號通路在細胞抗氧化和外源性有毒物質誘導的主要防御機制中發揮著極其重要的作用[6]。既往研究[7]顯示，Keap1-Nrf2信號通路的紊亂是胰腺功能障礙的驅動力，重新激活Nrf2可有效減輕組織損傷、恢復組織的功能，對糖尿病的預防和治療具有重要意義。

民族藥艷山姜為姜科山姜屬植物Alpiniazerumbet(Pers.) Burttet Smith，前期研究表明，艷山姜的主要有效成分為揮發油(essential oils fromFructusAlpiniaezerumbet，EOFAZ)，具有廣泛的抗炎、抗氧化以及防治心血管系統疾病等多方面的生物活性[8]。最近課題組研究提示，EOFAZ可明顯改善糖尿病視網膜病變的發生發展[9]，但其對糖尿病應激下胰腺組織損傷的作用以及作用機制尚不明確，故本研究探討其對糖尿病誘導的小鼠胰腺組織損傷的干預作用，明確其可能的作用靶點及途徑。

1 材料

1.1 實驗動物60只♂ C57BL/6小鼠購自貴州醫科大學動物中心，動物合格證號：SCXK(黔20180001)，實驗動物使用許可證號：SYXK(黔20180001)。動物實驗得到貴州醫科大學倫理委員會批準(No 2000499)。小鼠飼養在貴州醫科大學動物中心，室溫保持在20～23 ℃，相對濕度保持在40%～70%。

1.2 藥物及試劑于貴州省貞豐縣采摘的艷山姜果實，經貴州醫科大學藥學院生藥學與藥用植物學教研室龍慶德副教授鑒定為姜科植物AlpiniazerumbetPers. Burttet Smith的干燥成熟果實(憑證標本號：No 20151018)，按2015年版《中國藥典》(四部)通則2204揮發油測定法提取EOFAZ。收得率為1.3%。取EOFAZ，將其溶于吐溫80及甘油溶液(二者分別所占總體積的10%)中，使用生理鹽水補充體積。鹽酸二甲雙胍片購自于中美上海施貴寶制藥有限公司，批號：ABV4533。鏈脲佐菌素購自于美國Sigma公司，批號：HMBF 4669V。p62(18420-1-AP)，Keap1(10503-2-AP)，Nrf2(16396-1-AP)，HO-1(27282-1-AP)，Bax(50599-2-Ig)，Bcl-2(12789-1-AP)，β-actin(66009-1-Ig)一抗購自Proteintech公司。

1.3 主要儀器700-SERIES超低溫冰箱(Thermo 公司)，3020-426多功能全波長酶標儀(Thermo公司)，奧林巴斯熒光顯微鏡TS100(日本)，CFX型凝膠成像系統(美國Bio-Rad公司)，SIM-F140AY65型制冰機(日本SANYO電子有限責任公司)，自動生化儀(德國拜耳西門子公司)，5810R型冷凍離心機(德國Eppendorf公司)。

2 方法

2.1 動物模型的建立C57BL/6小鼠適應性飼養1周，尾靜脈取血、血糖儀測定小鼠空腹血糖(fasting blood glucose，FBG)，FBG<11.1 mmol·L-1的小鼠隨機分為為正常對照組(n=20)、糖尿病造模組(n=40)。正常對照組小鼠給予基礎飼料、糖尿病造模組小鼠給予高脂高糖飼料HFS飼養2個月后，過夜禁食12 h，尾靜脈取血(50～100 μL)，測定血清空腹胰島素及血糖水平，采用穩態模型(HOMA)評價胰島素抵抗(insulin resistance，IR)，當HFS組的HOMA-IR>對照組即認為胰島素抵抗形成，對產生胰島素抵抗的小鼠腹腔注射STZ(120 mg·kg-1)，正常對照組注射相同體積的枸櫞酸鈉緩沖液，72 h后測定血糖，FBG≥11.1 mmol·L-1的小鼠即被認為實驗性2型糖尿病(T2DM)模型建立成功。

2.2 分組、干預、取材將正常對照組小鼠隨機分為正常組(Control)和EOFAZ毒性組(180 mg·kg-1)，T2DM小鼠隨機分配為糖尿病組(DM)、EOFAZ低劑量組(90 mg·kg-1)、高劑量組(180 mg·kg-1)、二甲雙胍組(250 mg·kg-1)，每組均保留10只。EOFAZ組、二甲雙胍組分別灌胃EOFAZ和二甲雙胍的同時，正常組和DM組以等體積生理鹽水灌胃，每天一次。連續灌胃8周后處死小鼠，采血并取胰腺組織。

2.3 HE染色觀察胰腺組織的病理性變化切除部分胰腺泡于4%的多聚甲醛中，用于HE染色。石蠟包埋、切片、二甲苯脫蠟、梯度酒精(酒精濃度為100% Ⅰ，100% Ⅱ，95% Ⅰ，95% Ⅱ，80%，75%，三蒸水)脫水，然后用蘇木精染液染15 min，1%鹽酸酒精溶液分化5 s，碳酸鋰溶液藍化5 s，2%伊紅染液染色3 min，梯度酒精(酒精濃度分別為70%，80%，95% Ⅰ，95% Ⅱ，100% Ⅰ，100% Ⅱ)脫水。二甲苯溶液透明(切片于二甲苯Ⅰ中浸泡5 min，于二甲苯Ⅱ中浸泡5 min)，中性樹膠封片，于顯微鏡下采集照片(400×)。

2.4 免疫印跡分析切除部分胰腺凍存于-80 ℃，取胰腺組織30 mg，加入4倍體積RIPA與PMSF(二者比例為99 ∶1)，勻漿后12 000 r·min-1的轉速離心20 min，取上清，BCA蛋白定量試劑盒對蛋白進行定量，用濃度為12%的SDS-PAGE凝膠試劑盒將蛋白樣品(30 μg)進行電泳分離并將蛋白轉移至PVDF膜。5% BSA溶液封閉2 h后與p62(1 ∶2 000)，Keap1(1 ∶1 000)，Nrf2(1 ∶2 000)、HO-1(1 ∶1 000)、Bax(1 ∶2 000)、Bcl-2(1 ∶1 000)一抗在4 ℃下過夜孵育。次日，膜用1× TBST洗3次后與二抗室溫孵育1 h。膜洗3次后，用ECL化學發光試劑盒進行顯色，用Bio-Rad凝膠成像系統進行曝光，用Image-Lab軟件對數字圖像進行量化。

2.5 免疫組織化學切除部分胰腺固定于4%的多聚甲醛中，采用的是PV6000 Two-Step IHC Detection Reagent二步法檢測組織抗原表達。石蠟包埋、切片脫蠟、水化，3%過氧化氫室溫孵育10 min，以消除內源性過氧化物酶的活性，抗原修復，Nrf2(1 ∶200)一抗，在4 ℃下過夜孵育，孵育二抗后加入DAB染色液顯色，蘇木精復染后脫水，中性樹脂封片。于顯微鏡下采集照片(400×)。

3 結果

3.1 EOFAZ對小鼠空腹血糖的影響與正常組相比，小鼠經STZ誘導后空腹血糖(FBG)明顯升高，與DM組小鼠相比較，二甲雙胍組小鼠FBG水平明顯降低，EOFAZ對血糖無明顯影響(Fig 1)。

Fig 1 Effects of EOFAZ on FBG level in

3.2 EOFAZ對T2DM小鼠胰腺組織病理形態的影響HE染色結果表明，正常組的小鼠胰腺組織較為完整，胰島結構豐富飽滿，具有完整的β細胞，排列緊密，胰島與外分泌腺界限清楚。DM組小鼠的胰島結構不完整，邊界不均勻，模糊，內有空泡浸潤。給予EOFAZ后可減輕胰腺組織的病理形態，表現為胰島組織完整，胰島中β細胞排列緊密(Fig 2)。

Fig 2 Effects of EOFAZ on pathological observation of pancreatic tissues in mice(HE×400)

Fig 3 Effects of EOFAZ on expression of p62，Keap1，Nfr2 and Ho-1 in

3.3 EOFAZ對小鼠胰腺組織p62，Keap1，Nrf2 及Ho-1蛋白表達的影響與正常組相比較，DM組小鼠胰腺組織中Keap1蛋白表達明顯增加，Nrf2、Ho-1、p62蛋白表達明顯降低(P<0.05)。給予EOFAZ后，與DM組相比較，可明顯下調Keap1蛋白表達并上調Nrf2、Ho-1、p62蛋白表達(Fig 3)。免疫組織化學結果顯示，與正常組小鼠胰腺組織相比較，胰腺組織中Nrf2蛋白表達降低。給予EOFAZ后，可明顯上調Nrf2的表達(Fig 4)。

Fig 4 Effects of EOFAZ on expression of Nrf2 in pancreatic tissues (400×)

3.4 EOFAZ對小鼠胰腺組織凋亡信號Bax，Bcl-2蛋白表達的影響與正常組相比較，DM組小鼠胰腺組織中Bax蛋白表達明顯增加，Bcl-2蛋白表達明顯降低。給予EOFAZ后，與DM組相比較，可明顯下調Bax蛋白表達并上調Bcl-2蛋白表達(Fig 5)。

Fig 5 Effects of EOFAZ on expression of Bax and Bcl-2 in pancreatic tissues

4 討論

糖尿病是一類由于胰島素分泌缺陷及(或)其生物作用障礙而引起的，以慢性高血糖為主要特征的臨床綜合征[10]。糖尿病主要分為1型糖尿病(diabetes mellitus type 1，T1DM)和2型糖尿病(diabetes mellitus type 2，T2DM)，T1DM的特點是機體胰島功能完全喪失，T2DM的主要特點是由于胰島細胞胰島素分泌不足或是機體產生胰島素抵抗導致無法控制升高的血糖，使糖尿病持續惡化至無法逆轉。長期存在的高血糖可誘導組織臟器功能損傷，嚴重影響患者生活質量和壽命，給家庭及社會帶來沉重的負擔[11]。中藥在治療流行性疾病如心血管疾病和糖尿病等已取得較為可觀的結果[12]。民族藥艷山姜為姜科山姜屬植物Alpiniazerumbet(Pers.) Burttet Smith，已被收錄于2003版《貴州省中藥、民族藥標準》。課題組前期研究顯示，艷山姜的主要有效成分為揮發油(EOFAZ)，具有抗炎、抗氧化應激等生物活性。最新研究顯示EOFAZ對糖尿病視網膜病變具有明顯的改善作用。提示EOFAZ對糖尿病并發癥具有明顯的改善作用[9]。在本研究中，高糖高脂飼料飼養小鼠產生胰島素抵抗后，通過腹腔注射STZ成功建立T2DM小鼠模型。小鼠胰腺HE染色病理性觀察結果表明，EOFAZ可明顯改善糖尿病誘導的胰腺組織損傷。

隨著對T2DM的不斷深入研究，發現高血糖應激狀態下，可導致胰腺組織氧化與抗氧化系統失衡。高血糖誘導的氧化應激損傷及胰島β細胞凋亡是T2DM發生發展的最關鍵因素[13]。因此，尋找能有效改善胰腺氧化應激損傷的藥物尤為迫切。核因子E2相關因子2(nuclear factor -E2-related factor 2，Nrf2)是廣為人知的抗氧化防御的關鍵轉錄因子。正常生理狀態下，Nrf2由Keap1錨定，并在泛素化后被26S蛋白酶體快速降解，從而維持Nrf2在胞質-胞核中的表達平衡[14]，當機體氧化還原系統作用失衡發生氧化應激損傷時，Nrf2與Keap1解離后可由胞質轉移到胞核，激活抗氧化基因如血紅素加氧酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)等的表達[15]，從而發揮抗氧化作用，保護胰腺組織。p62是自噬常見的生物標志物之一，參與細胞內溶酶體的運輸和蛋白酶體降解泛素化過程，是Keap1/Nrf2通路上游重要的調控因子。p62蛋白表達上調可競爭性結合Keap1，抑制Nrf2泛素化，維持胞質胞核中Nrf2水平的穩定，從而誘導下游抗氧化基因的表達[16]。本研究發現，給予EOFAZ后，可明顯上調p62的表達，抑制Nrf2的降解，降低Keap1蛋白表達，促進下游抗氧化基因HO-1的轉錄，從而發揮抗氧化應激的作用。

胰腺組織損傷是導致β細胞功能障礙直至凋亡的關鍵因素。β細胞作為分泌胰島素調節血糖的重要細胞，對氧化應激損傷高度敏感。Bcl-2家族由抗凋亡蛋白(Bcl-2)和促凋亡蛋白(Bax)組成。氧化應激損傷發生時，促凋亡蛋白表達(如Bax)異常上調、抗凋亡蛋白(如Bcl-2)異常下調后可激活凋亡信號通路，從而誘發β細胞凋亡[17]。本研究結果表明，EOFAZ可明顯下調DM小鼠胰腺組織中Bax的表達，上調Bcl-2的表達。

綜上所述，EOFAZ對DM誘導的胰腺組織損傷具有明顯改善作用，其作用與活化p62/Keap1/Nrf2信號并促進其下游抗氧化基因表達，從而抑制凋亡相關，本研究為后期更進一步研究EOFAZ改善胰腺組織損傷，恢復胰腺功能提供實驗依據。為民族藥艷山姜防治糖尿病開拓新的理論指導與實驗基礎，對促進民族藥研究的現代化具有重要的社會意義。