多劑量光動力聯合姜黃素治療宮頸癌體外移植瘤及腫瘤組織中腫瘤壞死因子-α、半胱氨酸蛋白酶-8的表達研究

牟天龍 劉慧敏 潘彥舒 賀桂芳 李占穩 郭婕 龐大承 翟臻 吳自旭

宮頸癌是目前危害女性健康的第二大惡性腫瘤，具有高發病率，高病死率、發病年齡年輕化的特點，嚴重威脅女性健康[1]。光動力療法(photodynamic therapy，PDT) 是近年來新興的一種療法，具有操作簡便、創傷小、定位準確、治療時間短，價格低廉等優點，在腫瘤治療方面有著廣闊的前景[2]。目前唯一批準應用于臨床的光敏劑為苯卟啉衍生物單環酸A，此外常用于實驗研究的還有5-氨基酮戊酸等，這些均屬于二代光敏劑。但因傳統光敏劑有著對皮膚、眼睛及呼吸系統等不同程度的刺激作用，且本身并不具有良好的抑瘤效果，因此需要一種更為合理的光敏劑。1985年印度學者首先報道了姜黃素的抑瘤作用，且其本身可食用，毒副作用低，目前美國國立腫瘤研究所將其列為第三代癌化學預防藥[3]。此外，姜黃素具有較好的光敏性，既能夠協同、也能單獨發揮抗癌功效，這在本研究團隊過去的研究中已經證實[4]，因此本實驗選擇姜黃素做為光敏劑聯合不同劑量及治療頻次的光動力療法進行研究，以便找到合理的治療參數，同時對其抑瘤機理做進一步探討。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及細胞

雌性 BALB/c 裸鼠60只 (北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物合格證編號SCXK(京)2016-0011)，實驗動物使用許可證SYXK(京)2017-0033 ，飼養于北京中醫藥大學科研實驗室IVC動物房，倫理審批號：BUCM-4-2018122101-4065。宮頸癌Hela細胞(北京協和醫學院饋贈)。

1.2 主要儀器及試劑

姜黃素(Bioruler 公司，美國，貨號：RB12712，規格20 mg)。445 nm激光器(北京鐳志威光技術有限公司 BL18111611)，腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)(abcam-ab6671)，半胱氨酸蛋白酶-8(Caspase-8)(abcam-Ab25901)，山羊抗兔二抗，即用型二步法檢測試劑盒 PV9000(北京中杉金橋)， BCA蛋白定量試劑盒、eECL-Westen Blot高靈敏度化學發光檢測試劑盒、光譜彩虹預染蛋白Marker(康為世紀公司)，組織細胞裂解液(北京普利萊公司)，臺式冷凍離心機Eppendorf(USA)，凝膠成像分析系統Tanton-4500(CHN) 。

1.3 造模

體外培養宮頸癌細胞，將腫瘤細胞調整為2.5×107/mL，每只裸鼠背部皮下注入100 μL，約2.5×106個細胞，經過一周的潛伏期，可見背部出現米粒大小的腫塊，提示造模成功(成模率100%)，待腫塊直徑為0.8～1.0 cm時，進行后續實驗，具體造模方法詳見參考文獻4。

1.4 實驗方法

1.4.1 光照參數 具體光動力治療儀參數如下：光動力治療儀為432 nm波長，0.60 A，0.54 W，距離腫瘤表面3～5 cm，照射時間為14秒時，能量為40 J/cm2；照射時間為21秒時，能量為60 J/cm2；照射時間為28秒時，能量為80 J/cm2。(既往實驗研究中，采用100 J/cm2的光照劑量時，腫瘤表面皮膚出現變黑、干枯、壞死的情況，副作用損傷過于明顯，同時影響了后續的檢測結果，因此本實驗降低了光照劑量，意在降低對皮膚的損傷及對實驗結果的干擾因素)。

1.4.2 實驗分組及治療方法 將制備好的模型隨機分為10組，每組6只，1～9組給予50 mmol/L濃度的姜黃素100 μL，于腫瘤內部多點均勻注射。具體分組情況如下：組1為：姜黃素+1次40 J/cm2的光照治療；組2為：姜黃素+1次40 J/cm2，24小時后重復40 J/cm2的光照治療，組3為：姜黃素+1次40 J/cm2，并分別于24小時及48小時后再次分別給予1次40 J/cm2的光照治療；組4為姜黃素+1次60 J/cm2的光照治療；組5為：姜黃素+1次60 J/cm2的光照治療，24小時后，重復給予1次60 J/cm2的光照治療，組6為：姜黃素+1次60 J/cm2的光照治療，并于首次光照治療后24小時及48小時分別給予1次60 J/cm2的光照治療；組7為：姜黃素+1次80 J/cm2光照治療；組8為：姜黃素+1次80 J/cm2的光照治療，24小時后重復1次80 J/cm2的光照治療，組9為：姜黃素+1次80 J/cm2的光照治療，并于首次治療后24小時及48小時分別給予1次80 J/cm2的光照治療；組10為模型組：皮下注射生理鹽水，給予正常燈光照射。各組均于完成最后1次治療后24小時取材。模型組為成模1天后取材。取材后，每只裸鼠背部腫瘤一半置于固定液中用于蘇木精—伊紅染色( hematoxylin-eosin staining，HE)觀察及免疫組織化學檢測，另一半置于液氮中保存，用于蛋白免疫印跡(Western-Blot，WB)法檢測。

1.5 HE觀察各組腫瘤細胞形態學改變。

將取出的瘤體迅速置于4%的多聚甲醛溶液中充分固定，使用脫水機常規脫水、經石蠟包埋、切片、HE染色后，顯微鏡觀察并對比各組間腫瘤組織及細胞學改變，有無組織壞死及細胞凋亡情況。

1.6 免疫組織化學染色檢測各組腫瘤組織TNF-α及Caspase-8的蛋白表達情況

將制備好的切片脫蠟處理，枸櫞酸鈉熱修復，經一抗孵育(4℃過夜)、PBS沖洗，二抗37℃ 孵育20分鐘，PBS沖洗，DAB顯色，復染、鹽酸酒精分化后，脫水、封片。圖片使用Image Pro Plus免疫組化分析軟件進行分析，檢測出積分光密度(integrated optical density，IOD)及陽性細胞面積(AREA)數值，以IOD/AREA的數值為最終結果[5]。

1.7 WB法檢測

取腫瘤組織剪碎，加入細胞裂解液充分裂解后，離心取上清。BCA 測定蛋白濃度后，加入loading-buffer煮沸，使蛋白充分變性，分裝備用；樣本SDS-PAGE電泳后，經轉膜、封閉、一抗孵育過夜、二抗孵育后顯色拍照，灰度值采用Image J軟件分析。以各組的灰度值/對應β-acting的灰度值為最終結果[6]。

1.8 統計學處理

2 結果

2.1 各組裸鼠腫瘤的肉眼觀察及病理學評價

2.1.1 肉眼觀察 各組在三種不同的光照下，均未出現(周邊)皮膚干枯、變黑及壞死的情況，證明所選劑量不會對周邊正常組織造成損傷。

2.1.2 病理學評價 模型組腫瘤組織呈實性、浸潤性生長，腫瘤細胞核大，深染，染色質粗糙，核漿比高，異型性明顯。經姜黃素聯合光動力治療后，各組腫瘤組織均有不同程度的壞死，腫瘤組織排列稀疏，有裂隙，腫瘤細胞體積縮小，細胞核有固縮，部分可見核周空暈甚至泡狀核。在同等照射強度下，治療次數越多，壞死情況越顯著；同等治療次數條件下，光照劑量小的較為明顯，其中以組3(小劑量3次治療組)壞死最為明顯。如圖1。

注：組1～3光照40 J/cm2，治療次數分別為1～3次；組4～6光照60 J/cm2，治療次數分別為1～3次；組7～9光照80 J/cm2，治療次數分別為1～3次，組10為模型組。圖1 各組裸鼠腫瘤組織HE染色圖片(HE，×200)

2.2 各組裸鼠TNF-α及Caspase-8的免疫組織化學表達情況

模型組TNF-α表達較低，其余各組較模型組表達均有不同程度的升高，其中組1、2、3、4、6、8有統計學差異(P<0.01)。在同等光照強度下：組1、2、3間比較，組3表達高于組2及組1，且均有統計學差異(P<0.01)；組4、5、6間比較，組4高于組5(P<0.01)，組6高于組5(P<0.01)，組4及組6間無統計學差異(P>0.05)；組7、8、9間比較，組7低于組8，但無統計學差異(P>0.05)，組7高于組9(P<0.01)，組8高于組9(P<0.01)。同等治療次數下：組1、4、7間比較，組7表達低于組1及組4(P<0.01)，組1及組4間無統計學差異(P>0.05)；組2、5、8間比較，組2高于組5及組8(P<0.01)，組5與組8間無統計學差異(P>0.05)；組3、6、9間比較，組3高于組6及組9(P<0.01)，組6高于組9(P<0.01)。綜上分析，小劑量光照聯合多次治療時，TNF-α表達最顯著。見圖2，表1。

注：組1～3光照40 J/cm2，治療次數分別為1～3次；組4～6光照60 J/cm2，治療次數分別為1～3次；組7～9光照80 J/cm2，治療次數分別為1～3次，組10為模型組。圖2 各組裸鼠腫瘤組織TNF-α免疫組化表達圖片(IHC，×200)

模型組Caspase-8表達較偏低，組2～8較模型組相比Caspase-8表達均具有統計學差異(P<0.05)。其余各組間比較，同等光照強度下：組1、2、3間比較，組3表達高于組2(P<0.01)，組3高于組1(P<0.01)；組4、5、6間比較無明顯統計學差異(P>0.05)；組7、8、9間比較，無明顯統計學差異(P<0.05)。同等治療次數下：組1、4、7間比較，組4高于組7及組1，組1和組4間具有統計學差異(P<0.05)；組2、5、8間比較，組間無統計學差異(P>0.05)；組3、6、9間比較，組3高于組6(P<0.05)，組3高于組9(P<0.01)。綜上分析，小劑量光照聯合多次治療時Caspase-8表達最顯著。見圖3，表1。

表1 各組裸鼠腫瘤組織TNF-α及Caspase-8免疫組化表達比較

注：組1～3光照40 J/cm2，治療次數分別為1～3次；組4～6光照60 J/cm2，治療次數分別為1～3次；組7～9光照80 J/cm2，治療次數分別為1～3次，組10為模型組。圖3 各組裸鼠腫瘤組織Caspase-8免疫組化表達圖片(IHC，×200)

2.3 各組大裸TNF-α及Caspase-8的WB表達情況

TNF-α表達：與模型組相比，組1、2、3、5、6表達升高，具有統計學差異(P<0.01)。同等光照強度下：組1、2、3間比較，組2及組3均較組1有統計學差異(P<0.01)，組3高于組2(P<0.01)；組4、5、6間比較，組5高于組6及組4(P<0.01)，組6高于組4(P<0.01)；組7、8、9間比較，組9及組8均較組7有統計學差異(P<0.01)，組8及組9間無統計學差異(P>0.05)。同等治療次數下：組1、4、7間比較，組1高于組4及組7(P<0.01)，組4與組7間無有統計學差異(P>0.05)；組2、5、8間比較，組2高于組5，但無統計學差異(P>0.05)，組2高于組8(P<0.01)，組5高于組8(P<0.01)；組3、6、9間比較，組3高于組6及組9(P<0.01)，組6高于組9(P<0.01)。見圖4，表2。

Caspase-8表達：與模型組相比，組3、5、6、7、8、9表達升高，具有統計學差異(P<0.01)。同等光照強度下：組1、2、3間比較，組2及組3均高于組1(P<0.01)，組3高于組2(P<0.01)；組4、5、6間比較，組5高于組4(P<0.05)，組6高于組4(P<0.01)，組5及組6間無統計學差異(P>0.05)；組7、8、9間比較，組7與組8間無統計學差異(P>0.05)，組7高于組9(P<0.01)，組8高于組9(P<0.01)。同等治療次數下：組1、4、7間比較，組7高于組4及組1(P<0.01)，組4高于組1(P<0.01)；組2、5、8間比較，組2低于組5及組8(P<0.01)，組5低于組8(P<0.01)；組3、6、9間比較，組3高于組6(P<0.05)，組3高于組9(P<0.01)，組6及組9間無統計學差異(P>0.05)。見圖4，表2。

綜上分析，同等光照強度下，TNF-α表達與治療次數呈正相關趨勢；在同等治療次數的條件下，TNF-α表達與光照強度呈負相關趨勢。同等光照強度下，Caspase-8的表達與治療次數呈正相關性，而在同等治療次數的條件下，當治療1～2次時，Caspase-8表達與光照強度呈正相關；當治療次數為3次時，Caspase-8表達與光照強度呈負相關。當光照強度為40 J/cm2，治療次數為3次時，TNF-α與Caspase-8表達最為顯著。見圖4，表2。

圖4 各組祼鼠腫瘤組織WB表達結果

表2 各組裸鼠腫瘤組織TNF-α及Caspase-8WB表達結果

3 討論

宮頸癌是危害女性生命健康的第二大惡性腫瘤，近年來研究表明，其發病年齡呈現出年輕化的趨勢[1]。光動力療法是一種無創或微創的新型治療技術，具有操作簡單、對患者傷害小、治療后可保護器官結構的完整性以及可重復治療等優勢[2]，且光動力治療能使包括宮頸癌細胞在內的多種腫瘤細胞發生明顯的形態學改變，增加細胞毒性、降低細胞的增值力和活性[4,7-9]。光敏劑的選擇對于光動力治療的效果尤為重要。傳統光敏劑為化學性光敏劑，雖然具有較好的光敏活性，但對身體具有一定的副作用，如刺激眼睛、皮膚及呼吸系統等。而姜黃素是中藥提取物，相較于傳統化學光敏劑，除了同樣具有較強的光敏性以外，還具有毒副作用低，自身殺滅腫瘤的功能，在前期研究中將姜黃素聯合光動力治療宮頸癌已取得滿意療效[3]，但由于對光照劑量及頻次的把握不足，在治療時造成了皮膚組織的損傷，因此本實驗在光動力療法的光照劑量及治療頻次方面進行了細致研究，并對其機制做進一步研究。

TNF-α超家族是一種死亡受體，有富含半胱氨酸結構域和死亡結構域組成，在傳遞與細胞死亡有關的信息方面，發揮著重要作用。特別是在腫瘤的發生和發展，如參與組織細胞的損傷與壞死，并介導其他細胞因子、免疫調節因子參與細胞的增生、分化以及凋亡等[11]。對于最初TNF-α的研究表明，其能夠誘導癌組織的快速出血和壞死[12]，但隨著近些年研究的深入，對TNF-α的主要研究更傾向于其促進腫瘤的生長[13]。在對腫瘤及周邊正常組織的研究中發現，正常組織中TNF-α的表達為陰性，而對研究的腫瘤組織的檢測發現，TNF-α出現陽性表達[14]，扮演著促進腫瘤發生、生長的角色。因此TNF-α在腫瘤中的表達中具有雙向性，這可能與腫瘤壞死因子相關誘導凋亡配體有關[15-16]。TRAIL在人類中有四個受體[17]，兩個死亡受體(death receptor，DR)4和DR5，以及兩個誘騙受體(decoy receptor，DcR)1和DcR2，TNF-α能和兩個死亡受體結合形成死亡結構域，可以誘導細胞的凋亡，而誘騙受體則以相似的結合力和競爭力與TRAIL結合，由于缺乏胞內結構域[18]，并不能誘導細胞凋亡。因此，配體有受體的復雜關系，越來越多的應用于癌癥的治療。當TNF-α被激活后，可以招募下游的Fas相關受體死亡結構域組成信號傳導復合體，并進一步活化Caspase-8,引發細胞凋亡[19]。普遍認為細胞死亡的方式有兩種，但無論是通過內源性還是外源性途徑，都依賴于Caspase家族[20]。Caspase-8是一種半胱氨酸—天冬氨酸特異性蛋白酶，可觸發外部凋亡通路，參與細胞表面死亡受體的激活，被激活的Caspase-8可以直接切割并激活Caspase效應體(如Caspase-3)，參與內源性凋亡通路，使得線粒體外膜透化和線粒體促凋亡成分釋放到細胞質中，最終引發凋亡。除了凋亡作用以外，Caspase-8還參與調節細胞遷移和黏附，并在胚胎發育和癌癥進展中發揮重要作用[21-22]。

本實驗研究中發現，治療1天后，各組HE觀察腫瘤細胞具有不同程度的壞死，其中以組3(小劑量多次治療組)壞死程度最佳。TNF-α表達方面，在相同光照劑量，不同治療次數的情況下，多次治療TNF-α表達最高，而在相同治療次數，不同光照劑量的情況下，TNF-α以小劑量光照表達最高。Caspase-8在免疫組化的表達方面基本與TNF-α相同，而在WB表達方面部分與前者相同，在相同光照劑量的前提下，多頻次治療時Caspase-8的表達較高，這與Kiro NE[23]及Anine等[24]的研究結果大致相同。

綜上所述，在用中藥單體姜黃素聯合光動力治療宮頸癌時，治療參數以小劑量多頻次效果最佳，能夠有效的殺滅腫瘤細胞，其機制與TNF-α/Caspase-8通路有關。本實驗仍有一些局限性，目前只對完成治療后1天的結果進行觀察，后續應繼續延長觀察時間，分多時間進行監測，以便對治療后腫瘤變化進一步觀察，同時應對TNF-α相關受體進行監測，進一步明確光動力的治療機理。