microRNA在HBV感染和致病中的作用研究進展

張 坦，賈曉蘭，曹 麗，楊 明，傅占江，代曉朋

HBV感染是一個全球性的公共衛生問題。全球有約20億人感染過HBV，慢性HBV攜帶者超過2.5億，每年約80萬患者死于HBV相關的疾病[1]。慢性HBV感染導致免疫介導的肝損傷和癌變，最終可發展為肝細胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）。據報道，雖然疫苗接種有效降低了新生兒HBV感染率，但如果不采取干預措施，2015—2030年將累計將出現6300萬例新的慢性HBV感染者和1700萬例HBV相關死亡病例[2]。干擾素和核苷酸/核苷類似物等藥物可抑制HBV復制并緩解肝臟病變，但停藥后病毒易復發、長時間用藥可導致病毒耐藥突變和其他不良反應等限制了治療效果，并且無法徹底根除患者體內的HBV cccDNA[3]。目前，HBV在人肝細胞中建立持續感染和致病的分子機制尚不清楚，通過尋找新的HBV感染和致病靶點，開發耐受性更好的治療策略，對于治療和預防HBV感染和致病至關重要。

微 小 RNA（microRNA, miRNA） 是 由19～23個核苷酸組成的小的非編碼RNA，通過與目標轉錄本的3’-非翻譯區（untranslated regions, UTR）配對，抑制翻譯和/或降解mRNA，進而調節基因表達，在細胞增殖、分化、癌變、抗病毒等多種生物過程中發揮重要作用[4]。

miRNA是HBV-宿主相互作用的重要調節因子，參與了HBV感染、復制和HBV相關疾病的調節[5]。人體內的miRNA可通過直接與HBV轉錄本結合影響HBV復制，或通過靶向與HBV生命周期相關的細胞因子間接影響HBV復制。反之，HBV感染可導致細胞miRNA表達水平的變化，這些miRNA參與調節在HBV致病中起關鍵作用的細胞基因和信號通路，在HBV致病中發揮重要作用。

1 宿主細胞miRNA調控HBV復制和表達

1.1 直接抑制HBV復制和表達 宿主細胞的miRNA可以直接與HBV轉錄本結合進而抑制HBV復制和表達。Zhang等[6]首先發現了能夠直接靶向HBV轉錄本的miRNA，他們在HepG2.2.15細胞中通過功能缺失的方法，分別敲除328個miRNA，發現miR-199a-3p和miR-210可有效降低HBV復制和HBsAg表達水平。通過生物信息學分析顯示，miR-199a-3p和miR-210分別通過直接靶向HBV基因組的HBsAg編碼區和前S1區，進而抑制HBV復制和表達。Potenza等[7]研究發現，miR-125a-5 p的種子序列與HBV表面抗原的編碼序列互補配對，抑制病毒表達，從而減少HBsAg分泌量，進而還可能抑制HBV復制。后續研究還發現許多與癌癥相關的miRNA，包括miR-15a/miR-16-1[8]、miR-20a 及 miR-92a-1[9]、miR-1236[10]都可以直接與HBV mRNA互補配對并抑制HBV復制和表達。在HBV的研究中發現，肝臟表達豐度最高且具有肝臟特異性的miR-122可通過堿基互補配對靶向HBV聚合酶mRNA和核心蛋白mRNA的3’-UTR，抑制HBV復制和表達，臨床試驗進一步表明，HBV陽性患者體內miR-122水平與外周血單個核細胞中的病毒載量呈負相關，表明miR-122可抑制HBV復制，導致HBV的持續/慢性感染[11]。

1.2 間接抑制HBV復制和表達 某些宿主細胞的miRNA雖然在HBV基因組中沒有直接的結合位點，但可以通過靶向其他宿主因子，通過作用于啟動子和增強子而間接調節HBV復制。HBV的轉錄主要受4個啟動子（即核心、前S1、前S2/S和X啟動子）和2個增強子（ENI和ENII）的調節，它們在HBV復制中起著關鍵作用[12]。核因子I（nuclear factor I, NFI）是一種位點特異性的DNA結合蛋白，由NFIA、NFIB、NFIC、NFIX 4種蛋白轉錄因子組成，可以特異性結合HBV增強子和啟動子，影響HBV復制[13]。NFIA可直接調節HBV增強子I活性來促進HBV復制。Fan等[14]研究發現，miR-370可以靶向抑制NFIA，降低HBV增強I/C啟動子活性，進而抑制HBV復制和表達。富含半胱氨酸和組氨酸的結構域1（cysteine- and histidine-rich domain containing 1,CHORDC1）是一種熱休克蛋白，能夠通過促進HBV啟動子/增強子的活性而促進HBV的復制和表達。Zhao等[15]研究發現miR-26b通過直接抑制CHORDC1的表達而抑制HBV增強子/啟動子活性，抑制HBV轉錄、基因表達和復制。過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferatoractivated receptor, PPAR） 由 PPARA、PPARB和PPARC組成，是屬于核激素受體超家族的配體激活轉錄因子[16]。PPARA與HBV基因組前RNA合成和病毒復制相關，在HBV核心啟動子、前S1啟動子、X啟動子、ENI和ENII都含有PPARA結合位點，PPARA可反式激活HBV啟動子和增強子[17]。Hu等[18]研究發現，miR-141通過直接與PPARA mRNA 3’-UTR結合抑制PPARA表達，降低HBV啟動子和增強子轉錄活性，進而抑制HBV的復制和表達。此外，miR-29c通過靶向腫瘤壞死因子α誘導蛋白3降低S1啟動子活性[19]，miR-185-5p通過直接靶向調節轉錄因子1抑制S1啟動子活性[20]，從而最終抑制HBV的復制和表達。肝臟的富含的轉錄因子和核受體可以結合HBV啟動子/增強子元件，并在激活和調節HBV轉錄中起關鍵作用，miRNA通過調控轉錄活性的轉錄因子，間接調節HBV復制和表達。

1.3 促進HBV復制與表達 目前尚無miRNA直接靶向HBV促進病毒復制其復制和表達的報道，某些miRNA可通過靶向宿主基因促進HBV復制和表達。HBx相互作用蛋白（hepatitis B X-interacting protein, HBXIP）是一種與HBx蛋白結合的人類蛋白，可通過與HBx相互作用來降低 HBV復制。miR-501通過靶向抑制HBXIP表達，增強HBV復制[21]。活化的STAT 2蛋白抑制劑（protein inhibitor of activated STAT 2, PIAS2）是轉錄蛋白的信號轉導和激活劑，通過阻斷轉錄因子與DNA的相互作用來調節基因表達。在HBV感染中，PIAS2可抑制HBV復制和表達。miR-137能夠靶向抑制PIAS2表達，進而促進HBV的復制和表達[22]。干擾素介導的抗病毒作用是細胞對病毒感染反應的重要組成部分。miRNA-548可以直接靶向并抑制干擾素-λ1的表達，調節宿主抗病毒反應，有助于HBV感染和復制[23]。以上促進HBV復制的miRNA，大多是通過調控宿主體內影響HBV復制的負性細胞調節因子的模式發揮作用。

miRNA通過靶向HBV自身的調節因子促進HBV復制和表達。NFIB是一種下調HBV增強子I和核心啟動子活性的轉錄因子。miR-372/373能夠直接靶向抑制NFIB的表達，增強HBV增強子I和核心啟動子活性，進而促進HBV表達[24]。SMARCE1是染色質重塑復合物家族的成員，在轉錄調控中發揮關鍵作用。在HBV感染中，SMARCE1通過與HBV核心啟動子結合抑制HBV的表達和復制[25-26]。miR-802和miR-29a都可以通過靶向抑制SMARCE1，促進HBV核心啟動子活性，進而促進HBV復制和表達[25-27]。E盒結合鋅指蛋白2（E-box binding zinc finger protein 2,ZEB2）是ZEB轉錄因子家族的一個成員，在參與腫瘤發生的TGF-β/BMP通路中發揮重要作用。在HBV感染中，ZEB2通過靶向抑制HBV核心啟動而抑制HBV的復制和表達[28]。miR-146可以直接靶向抑制ZEB2的表達，提高HBV核心啟動子的活性，進而促進HBV的復制和表達[29]。此外，miR-15b[30]，miR-1[31]等都是通過間接調節HBV啟動子和增強子活性促進HBV的復制和表達。

miRNA還可在表觀遺傳學水平上調控HBV的復制和表達。HBV cccDNA的甲基化和去乙酰化等表觀遺傳修飾，通過調控HBV cccDNA轉錄為mRNA，在控制HBV復制中發揮關鍵作用。組蛋白的乙酰化和去乙酰化是基因表達調控的重要機制，組蛋白的乙酰化促進轉錄，而組蛋白的去乙酰化抑制轉錄，這一過程主要由組蛋白乙酰化轉移酶和組蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase,HDAC）調節。HDAC4調節HBV cccDNA結合組蛋白的去乙酰化，抑制HBV的轉錄和表達。miR-1和miRNA-548ah通過直接與HDAC4結合抑制HBV cccDNA結合組蛋白的去乙酰化，提高HBV cccDNA轉錄，進而促進HBV的復制和表達[31-32]。

miRNA還可通過調節肝細胞的自噬，影響HBV的復制和表達。自噬參與先天免疫系統對病原微生物的識別，有利于病原體的吞噬和清除。研究表明，在HCC細胞系中通過抑制中的Akt/mTOR信號通路可以增強肝細胞自噬，從而正向調節HBV復制。Wang等[33]發現miR-192-3p可通過靶向X連鎖的凋亡抑制蛋白調節NF-κB信號通路，進而刺激細胞自噬，促進HBV復制和轉錄。鋅指蛋白143（zinc finger protein 143, ZNF143）是一種調節細胞周期相關基因的轉錄激活因子。Li等[34]研究發現，HBV感染者血清miR-192-3p水平與HBV DNA和HBsAg水平呈正相關，進一步的分子機制研究表明，miR-192-3p通過靶向HepG2細胞中ZNF143來抑制Akt/mTOR信號通路增強細胞自噬，從而促進HBV復制和轉錄。miR-155可以靶向細胞因子信號抑制因子（suppressor of cytokine signaling, SOCS）1抑制Akt/mTOR信號通路，刺激細胞自噬，從而促進HBV的復制與表達[35]。此外，miR-146a-5p介導的MDM2/p53軸在自噬過程的起始階段誘導肝細胞的自噬，進而促進HBV復制[36]。

2 宿主細胞miRNA參與HBV致病

慢性HBV感染可導致肝炎、肝硬化，甚至HCC，這一復雜過程涉及肝細胞反復破壞和再生等多種遺傳和表觀遺傳變化，在這些改變中，miRNA異常表達起著至關重要的作用。

2.1 miRNA與肝臟炎癥 HBV是一種非致細胞病變病毒，HBV感染引起宿主免疫反應，導致肝臟炎癥。miRNA在HBV所致的肝臟炎癥中發揮重要作用。Li等[37]研究發現，HBx通過NF-κB信號通路促進先天免疫相關miR-146a的表達，補體因子H（complement factor H, CFH）是補體激活替代途徑的重要負性調節因子，miR-146a靶向抑制CFH表達，促進導致 肝臟炎癥。HBx-miR-146a-CFH-補體激活調節通路介導了HBV感染所導致的肝臟炎癥。HBeAg通過PI3K和NF-κB信號通路促進巨噬細胞中miR-155的表達，增加的miR-155通過抑制BCL-6、SHIP-1和SOCS-1的表達促進炎性細胞因子的產生[38]。此外，研究發現miR-122、miR-132在肝臟炎癥相關的先天性和適應性免疫中具有重要功能[39]，同時也受HBV的調控，在HBV所介導的肝臟炎癥中的作用及機制需要進一步的深入研究。

2.2 miRNA與HBV相關的肝纖維化和肝硬化 HBV感染產生的細胞外間質不平衡引起持續性炎癥，進而導致肝纖維化。肝星狀細胞（hematopoietic stem cell, HSC）是肝纖維化相關的主要效應因子。Guo等[40]鑒定了在HSC激活過程中差異表達的miRNA，發現miRNA通過不同的信號通路參與HSC激活，在肝臟纖維化過程中發揮重要作用。研究發現，母親信號蛋白同源物7（drosophila mothers against decapentaplegic protein 7,Smad7）表達的缺失或抑制與組織纖維化、炎性疾病以及腫瘤等密切相關[41]。Huang等[42]研究發現，慢性HBV感染導致肝星狀細胞HSC miR-33a水平升高，miR-33a通過直接靶向抑制Smad7的表達，促進肝纖維化的進展。

2.3 miRNA與HBV相關HCC HCC是最常見的惡性腫瘤之一，在亞洲90%的HCC是由HBV感染引起。盡管在HBV相關HCC的早期診斷和治療方法方面已取得顯著進展，但是HBV促進HCC發展的詳細分子機制仍不清楚。研究發現，miRNA可作為癌基因或抑癌基因在HBV相關HCC發生中起重要作用。Li等[43]對與HBV和HCV相關HCC患者的血清進行測序，發現13個miRNAs在HBV相關HCC病例中存在表達差異，可以準確區分HBV攜帶者、HCV攜帶者和健康者，其中miR-375和miR-92a具有HBV特異性。miR-122是肝臟中含量最高的miRNA，占肝臟總miRNAs含量的70%。N-myc下游調節基因3（N-myc downstream-regulated gene, NDRG3）是一種腫瘤激活因子，導致腫瘤的惡性表現，在HBV相關HCC的臨床腫瘤標本和表達HBV抗原的HepG2.2.15細胞系中均高表達。研究發現，miR-122抑制了NDRG3的轉錄和表達，從而逆轉了腫瘤細胞的惡性表型，其通過靶向NDRG3在HBV相關的HCC發生中發揮重要作用[44]。在另一項研究中，HBV感染導致miR-122水平降低，促進垂體瘤轉化基因結合因子的過度表達，進而促進了HCC細胞的生長和侵襲[45]。此外，miR-122表達降低與細胞周期蛋白G1的上調有關，它促進了鼠雙微基因2（一種p53的阻遏蛋白）的去磷酸化，并導致HCC細胞的增殖[46]。研究發現，在HBV感染中，參與抑制細胞增殖的miRNAs（miR-15 b、miR-22、miR-26a/b、miR-29c、miR-145 和 miR-199-a-3 p）在HBV相關HCC中表達下調，而一些癌基因樣miRNAs（miR-17-92簇和miR-21、miR-181a、miR-143、miR-602）在HBV相關HCC中表達上調，這些異常表達的miRNAs在促進HCC過程中發揮重要作用[47]。

2.4 HBV編碼miRNA與HBV致病 2017年，Yang等[48]首次發現一種HBV編碼miRNA—HBV-miR-3，其在HBV感染的組織和細胞中高表達。在HBV感染患者體內，HBV-miR-3通過外泌體和HBV病毒粒子釋放到血液循環中，HBV-miR-3的表達水平與HBV感染急性期患者血清中的HBV載量呈正相關，HBV-miR-3可通過抑制HBV轉錄而抑制HBV的復制，表明HBV編碼的miRNA在HBV感染過程中，通過調節HBV轉錄本來控制自我復制。這種負反饋調節可能有助于解釋HBV感染如何導致肝細胞輕度損傷和維持持續感染的情況。進一步的研究發現，HBV-miR-3可以調節宿主基因表達[49]。SOCS5是HBV-miR-3的直接靶點，SOCS5的其下調可以激活STAT1，導致HBV感染HCC細胞中干擾素激活基因轉錄增強，促進干擾素的抗病毒作用；HBV-miR-3通過SOCS5/STAT1途徑還可促進巨噬細胞M1極化。Yao等[50]發現了另一種HBV編碼的miRNA——HBV-miR-2。HBV-miR-2通過直接靶向抑制TRIM35的表達和上調RAN表達，抑制細胞凋亡和增強上皮間質轉化，促進遷移和侵襲，從而促進HCC細胞增殖。HBV編碼miRNA的發現有助于深入理解HBV的感染和致病機制，為HBV感染的診斷和治療提供新的靶點和生物標志物。

3 小 結

miRNA在宿主-病毒相互作用中起關鍵作用。細胞miRNA可以通過直接結合HBV轉錄物或通過靶向與HBV生命周期相關的細胞因子，調節HBV轉錄和復制。反過來，HBV感染可改變細胞miRNA水平。HBV編碼的miRNA還可調節病毒感染狀態和病毒生命周期。

隨著我們對miRNA的研究不斷深入，HBV對細胞miRNA的影響以及miRNA在HBV感染和HBV相關HCC的發展過程中所起的作用將逐漸清晰。在肝病的不同臨床階段，血清/血漿中miRNA表達譜的改變為miRNA作為非侵入性生物標記物的應用開辟了新的視角。

在臨床應用方面，目前廣泛用于抗病毒治療的核苷/核苷酸類似物以及大多數細胞因子藥物其作用機理主要在HBV RNA轉錄后起作用抑制病毒復制，不直接影響其基因表達；而miRNA在轉錄水平上控制HBV，同時限制HBV復制和基因表達。因此，在HBV感染治療策略上基于miRNA的治療具有很好的前景，是HCC治療的潛在生物靶點。