水牛乳乳餅發酵菌種篩選及工藝優化

但 霞，曾慶坤＊，謝耀峰

1 中國農業科學院廣西水牛研究所，廣西南寧 530001

2 廣西水牛乳工程技術研究中心，廣西南寧 530001

0 引言

乳餅（Dairy Cake）是路南撒尼族地區的一種傳統乳制品，以香醇的風味和良好的可烹飪性而廣受歡迎。乳餅是一種典型的加熱酸凝鮮干酪，目前乳餅大多采用傳統作坊式生產，加工工藝沒有標準化；乳餅生產用的酸水，多為憑經驗自然生成，因此，存在微生物組成復雜，可能導致污染和產品質量不穩定等問題。而酸水質量直接影響到乳餅的產量、色澤、風味以及成型，沒有標準化的酸水使乳餅生產很難走向工業化、規模化[1～5]。因此，篩選發酵菌株建立標準化的生產工藝流程是乳餅產業化的發展方向。

廣西奶水牛存欄量4.42 萬頭，是我國水牛存欄第一的省份，水牛奶資源豐富，產量2.76 萬噸，位居全國首位[6]，但水牛奶深加工技術較為缺乏，產品形式及種類較為單一。因此，發展新型水牛乳加工技術，豐富水牛乳產品種類，對我區水牛產業發展壯大具有重要意義。

本研究利用云南乳餅的加工工藝，篩選優良的乳清發酵菌株，并通過正交試驗優化水牛乳乳餅的生產工藝，為乳清巴氏殺菌后接種鼠李糖乳桿菌RSF1，37 ℃發酵至乳清pH3.6停止；原料乳標準化，預熱至90 ℃，隨后降溫至70 ℃，分兩次添加發酵乳清，保溫凝乳4 min，過濾入模壓制2 h后放入4 ℃冷藏，所制得乳餅得率最高可得32.500%，質地細膩，奶香濃郁，可烹飪性強。

1 試驗材料與方法

1.1 試驗材料

生水牛乳：廣西水牛研究所種蓄場。

試驗菌株：水牛乳乳清自然發酵分得乳酸菌18 株。

試驗試劑：MRS肉湯培養基，MRS瓊脂培養基，廣州環凱微生物科技有限公司；游離脂肪酸檢測試劑盒，南京建成生物工程研究所；石油醚，乙醚，無水乙醇，鹽酸，三氯乙酸，鄰苯二甲醛等試劑，分析純，天津博迪化工股份有限公司。

試驗設備：FOSS120乳成分檢測儀，FOSS8400蛋白檢測分析儀，丹麥 福斯集團公司，TMS-Pro質構儀，美國FTC公司，ME204E分析天平，梅特勒-托利多中國公司，Galaxy 170s恒溫培養箱，德國艾本德公司，UV-800紫外分光光度計，上海元析儀器有限公司，Thermo D-37520冷凍離心機，美國賽默飛科技公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 發酵菌株篩選

將乳酸菌活化，用MRS肉湯37 ℃培養24 h，至生長對數期，傳代3 次，離心收集菌體，用無菌生理鹽水洗滌，按體積5.000%（v/v）接種巴氏滅菌乳清，37 ℃發酵48 h，檢測發酵液pH值、游離脂肪酸濃度和蛋白水解度，游離脂肪酸采用試劑盒方法檢測。

蛋白水解度（DH）檢測方法：稱取2 g乳餅樣品與10 mL三氯乙酸溶液（75.000%）混合，3 000 r/min，4 ℃離心15 min，取上清液用0.45 μm濾膜過濾，取30 μL濾液與1 mL鄰苯二甲醛混合，在室溫下保存2 min，用紫外分光光度計測340 nm波長下的吸光度，DH表示游離NH3基團在340 nm處的測量吸光度。

1.2.2 乳餅工藝單因素試驗

乳餅樣品的制備：新鮮牛奶，加熱75 ℃以上，添加發酵酸乳清（占牛奶15.000%～25.000%），攪拌，保溫凝乳（75～80 ℃，5 min），形成凝乳顆粒，過濾，壓制成型。

（1）原料奶不同蛋白脂肪比

分別調配蛋白脂肪百分比為0.55:1、0.6:1、0.65:1、0.7:1 的4 個比例的鮮水牛乳，用相同的乳餅工藝制作乳餅，測各比例得率。

（2）不同凝乳溫度

分別以65 ℃、70 ℃、75 ℃、80 ℃、85 ℃、90 ℃作為乳餅凝乳溫度，測定不同溫度對乳餅得率及質構的影響。

（3）不同乳清添加次數

取用相同量的乳清，設置1 次、2 次、3 次乳清添加，每次添加后攪拌均勻并保溫凝乳2 min，觀察不同乳清添加次數對乳餅得率的影響。

（4）不同預熱溫度

對比不同預熱溫度對乳餅得率的影響。

（5）不同乳清pH值

設置3 個梯度pH值3.30、3.60、3.90，觀察不同乳清pH值對乳餅得率，乳清添加量等因素的影響。

（6）不同加水量

設置原料乳不加水、10.000%、20.000%（w/w）3 個梯度加水情況，觀察乳餅得率。

1.2.3 乳餅工藝正交試驗

設置凝乳溫度，預熱情況，乳清pH值，乳清添加次數，4因素3水平正交試驗，具體試驗參數如表1所示。

表1 正交試驗因素及水平設計

1.2.4 乳餅理化指標

水分質量分數根據《GB 5009.3—2010 食品安全國家標準 食品中水分的測定》中常壓干燥法測定。蛋白質根據《GB/T 5009.5—2010 食品安全國家標準 食品中蛋白質的測定》采用微量凱氏定氮法（N×6.38）測定。脂肪根據《GB 5009.6—2016 食品安全國家標準食品中脂肪的測定》測定。乳餅得率= 鮮乳餅質量/原料奶質×100%。

乳餅質構測定：TPA質構儀，感應元件50.0 N，形變量25.000%，下降速度60 mm/s，最小作用力0.1 N，每個樣品取樣3 次，測3 次，取平均值。

1.2.5 數據處理

試驗數據采用SPSS 20處理，Origin 2018 作圖，正交計算采用Minitable 17.0設計并計算。

2 結果與分析

2.1 乳清發酵菌株篩選

菌株發酵乳清結果如表2所示。乳餅制作過程主要靠酸化的乳清在高溫條件下絮凝牛乳中的蛋白，因此，菌株的產酸能力需要較強，從表2可以看出菌株RSF1、PY7、D3發酵液pH值較低，相同發酵條件下，3 個菌株產酸能力更強，比較符合要求。游離脂肪酸和水解蛋白濃度則可以表明菌株水解蛋白和脂肪的能力，而脂肪酸和氨基酸是風味的主要來源[7～9]，因此，選擇分解脂肪蛋白能力強的菌株可以為發酵乳清帶來更多風味，更有利于乳餅風味的形成。從游離脂肪酸和蛋白水解度數據來看，菌株PY7均低于RSF1，菌株D3蛋白水解度略高于RSF1，但游離脂肪酸濃度明顯低于RSF1，綜合數據來看，菌株RSF1產酸快，且分解蛋白脂肪能力較強，符合試驗目的，所以選擇該菌株作為乳清發酵菌株。

表2 不同菌株乳清發酵液檢測結果

2.2 乳餅制作單因素試驗

如圖1A所示，經過不同蛋白脂肪比制作乳餅可知，相同加工條件下原料乳蛋白∶脂肪=0.65時乳餅得率最高，0.70比例次之，0.55最低。這說明蛋白越少，乳餅的得率越少，因此，在標準化的過程中，將蛋白脂肪的百分含量比調整為0.65更有利于生產。

從不同的凝乳溫度試驗（圖1B）可以看出，凝乳溫度隨著從65 ℃到90 ℃越來越高，凝乳時所需的乳清越來越少；65 ℃時保溫凝乳，所需要酸乳清的質量占原料乳的40.000%左右，70 ℃時即下降至24.000%，至90 ℃凝乳時，只需約14.500%，這是牛奶在加熱過程中形成磷酸鈣釋放H+而降低pH值，溫度越高酸度降低越明顯[10～12]。乳餅得率則在70 ℃時達到最高，75～90 ℃則隨溫度的升高迅速降低至22.000%左右，Fox等研究發現，70～75 ℃時乳清蛋白中的β-Lg蛋白結構展開，更容易與酪蛋白結合，且αs-CN和β-CN的解聚量在70 ℃左右達到最高；當加熱溫度高于70 ℃，蛋白解聚量與加熱溫度呈負相關[13，14]，與試驗中70～75 ℃樣品得率較高的結論相吻合。而陶亮等[2]的試驗中乳餅最高得率凝乳溫度為80 ℃，這可能是水牛乳原料、工藝等多方面的差異因素造成。從咀嚼力看，凝乳溫度越高，咀嚼力越大，凝乳溫度越高，蛋白絮凝結構越致密，硬度越高；而乳餅硬度較高時磨牙感強烈，食用感不佳，相對而言咀嚼力小的樣品口感更好。

圖1 乳餅單因素試驗對乳餅得率的影響

原料乳預熱后得率增加（圖1C），這說明延長高溫蒸煮時間更有利于此種條件下奶中更多蛋白的酸凝，酪蛋白是熱穩定性蛋白，而乳清蛋白為熱敏感性蛋白，易熱變性，變性的乳清蛋白發生分子內和分子間的相互作用形成凝聚物，加熱導致變性乳清蛋白與酪蛋白膠束表面蛋白結合，改變其膠束表面毛發狀結構，使膠束內部疏水性基團和Ca2+敏感蛋白暴露出來，進而發生強烈凝聚趨勢，且跟容易與Ca2+發生絡合[15]，所以在酸作用前，預熱加速了乳清蛋白的變性，使其更容易析出，但這是否是乳餅得率增加的原因，還需要進一步驗證。

從圖1D可以看出，隨乳清pH值的增加，乳餅得率相應增加，研究發現乳清蛋白中熱穩定性隨pH值增加而降低[16]，因此，在高pH值中乳清蛋白更容易變性析出。試驗中pH值3.30的乳清得率明顯低于pH值3.60和3.90樣品，但pH值3.90的乳清需要添加的量較多，不利于節能生產。傳統工藝中，原料乳直接在鍋中加熱，當原料乳固形物含量過高時容易出現糊鍋現象，所以在加熱水牛奶或羊奶時往往會加水稀釋，李昌盛等[17]還對加水量進行了對比發現將原料乳稀釋2 倍最佳。本試驗采用隔水加熱的模式，杜絕了糊鍋的現象，且經過試驗發現（圖1E）不加水生產乳餅得率反而高，且加水后原料體積增加，對生產能源及飲用水都造成了不必要的浪費。

不同的乳清添加次數所需要的乳清量也不同，圖1F試驗中1 次添加凝乳所需要的乳清最多，而2 次和3 次則相差不明顯，但3 次添加的乳餅得率較高。

2.3 乳餅工藝正交試驗結果

根據表3數據可知，2號處理的得率最高，可達32.500%，高于文獻記載得率[2]，對乳餅得率影響的主次順序為：乳清的pH>原料乳預熱>凝乳溫度>乳清添加次數，其最優工藝為A1B2C2D2；因此在發酵乳清時要嚴格控制乳清pH值。原料乳預熱情況對乳餅得率影響也較為顯著，對比9 個樣品的預熱情況來看，在70 ℃凝乳時（樣品1~3）未預熱樣品得率只有25.5%，而預熱后樣品均在30%以上；高溫凝乳樣品（樣品4~9）預熱對得率的影響大大降低，但得率均高于1號未預熱70 ℃凝乳樣品，說明加熱對增加乳餅得率有較大的作用，雖然文獻中表面高溫會使乳清蛋白變性析出[10，15]，但針對本研究的乳餅還需要進一步對蛋白成分檢測進行驗證。凝乳溫度對乳餅得率的影響較弱，說明試驗設置的溫度梯度范圍過小，但前期試驗表面，溫度過低會導致乳清的添加量大大增加，且未預熱的原料乳在低于70 ℃時凝乳對乳餅后續的可烹飪性有較大影響，因此，綜合各個因素選擇70~90 ℃的溫度區間。

從乳餅咀嚼力的計算結果來看（表3），對乳餅咀嚼力影響的主次順序為：凝乳溫度>乳清的pH>乳清添加次數>原料乳預熱，最優工藝為A1B3C1D2；乳清pH值在3.6和3.8試驗樣品結果不顯著，但高pH值會加大生產過程中使用的乳清量，從而造成能源及水的浪費；而較低的pH值則會延長乳清的發酵時間，占用發酵罐及消耗能量，或者需要加大接種量，因此需要對比具體的能源消耗以確定最優pH值。

表3 乳餅正交試驗結果

根據表4數據可知乳餅蛋白脂肪含量、咀嚼力、硬度均與得率呈負相關，水分含量與得率呈正相關，即水分含量越大，蛋白脂肪含量越低，乳餅咀嚼力和硬度越低；彈力3，4號處理較高，而7，8，9號樣品較低，說明凝乳溫度高，乳餅彈力有所減弱，但總體樣品間彈力差異不明顯；黏性則隨凝乳溫度的升高而升高，70℃時黏性1.24~1.87，90℃時升高至3.64，說明溫度越高，乳餅結構越致密。

表4 乳餅樣品理化及質構檢測結果

2.4 驗證試驗

根據正交試驗結果，選取兩種最優工藝進行放大驗證，結果如表5所示，A1B2C2D2工藝所制得樣品（1，2號）得率均在30%以上，明顯高于A1B3C1D2工藝樣品（3，4號），且在生產中，得率高的產品咀嚼力也相對較低，口感較佳，因此主要的判別指標為產品得率，故乳餅最優工藝為A1B2C2D2。

表5 驗證試驗

3 結論

經過一系列試驗表明，影響乳餅得率和咀嚼力的主要因素是乳清pH值及凝乳溫度。溫度越高，乳餅咀嚼力越大，因此，低溫凝乳所制乳餅口感更佳；乳清pH值越低則乳餅得率越低，但過高的pH值則會導致乳清添加量大大增加，會增加生產用水和耗能。通過正交試驗表明，乳餅的較大得率，低咀嚼力生產工藝為：原料乳提前預熱至90 ℃，隨后降溫至70 ℃，分兩次添加乳清并保溫凝乳，隨后過濾，在模具中壓制成型，其得率可達32.500%。