微小RNA靶向胰島再生源蛋白3A對(duì)肺上皮細(xì)胞增殖和凋亡的影響

王文濤 郭健 解敏 鄭志方 王燕

承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 1小兒內(nèi)科，2新生兒科（河北承德 067000）；3承德醫(yī)學(xué)院圖書館（河北承德 067000）

小兒肺炎是嬰幼兒期的常見病，容易引發(fā)全 身性炎癥反應(yīng)和多種病原菌感染［1-2］。目前小兒肺炎依然是致5 歲以下兒童死亡的重要因素之一［3］。肺上皮細(xì)胞覆蓋在肺泡上，具有屏障功能，也可作為病原體的重要識(shí)別系統(tǒng)［4］。

miRNA 是一類小分子非編碼RNA，具有轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)功能［5-6］。胰島再生源蛋白3A（REG3A）是一種分泌型蛋白，具有抗氧化、抗炎、抗凋亡等功能［7-8］。本研究通過生物信息學(xué)工具Target Scan以及結(jié)合閱讀相關(guān)文獻(xiàn)，篩選出幾種可能靶向抑制REG3A 的候選miRNA，包括：miR?425?5p、miR?137、miR?325?3p、miR?342?3p、miR?203a?3p 及miR?9?3p，擬通過檢測(cè)重癥肺炎患兒血清中以上miR?NA 與REG3A 是否異常表達(dá)，進(jìn)而探究該現(xiàn)象對(duì)肺上皮細(xì)胞增殖與凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 樣本來源選取2019年6月至2020年6月本院收治的86 例重癥肺炎患兒為研究對(duì)象（記為SP 組），男47 例，女39 例，年齡1～8 歲，平均年齡（4.27±0.43）歲。所有患兒均符合《兒童社區(qū)獲得性肺炎管理指南》的診斷標(biāo)準(zhǔn)。排除心肺功能不全、患其他呼吸系統(tǒng)疾病以及免疫系統(tǒng)缺陷者，入院前一個(gè)月未接受激素、抗菌類等藥物治療。同期選取本院進(jìn)行健康體檢的20 例兒童作為對(duì)照組，其中男14 例，女6 例，年齡3～9 歲，平均年齡（5.12±0.49）歲。所有參與本次研究的兒童均征得家長同意并簽署知情同意書，此外本研究已獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)許可。

1.2 主要材料與試劑肺上皮細(xì)胞系A(chǔ)549（中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫），胎牛血清（杭州四季青公司），青?鏈霉素、DMEM 培養(yǎng)液（美國Sigma 公司），TRIzol 和Lipofectamine 2000 試劑盒（美國Invitrogen公司），反轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)熒光定量PCR 試劑盒（日本Takara 公司），雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒（北京索萊寶公司），CCK?8 試劑盒和EdU 細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒（上海聯(lián)邁生物公司），Annexin V?FITC/7?AAD 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（上海貝博生物公司），抗體REG3A、Caspase?3、Bcl?2、Bax、p53、GAPDH（英國Abcam 公司），WT?REG3A 3'?UTR 和MUT?REG3A 3'?UTR 質(zhì)粒載體、引物序列、miRNA mimic 及陰性對(duì)照序列均交由上海生工生物工程公司合成構(gòu)建。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本收集重癥肺炎患兒和健康兒童均空腹（禁食>8 h）靜脈采血3 mL，置于混有EDTA 的離心管中，4 ℃下以4 000 r/min 離心10 min，吸取上層液相至預(yù)冷離心管，4 ℃下以12 000 r/min 離心15 min，取上清液保存于-80 ℃冰箱。

1.3.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 實(shí)驗(yàn)Trizol 試劑提取血清或細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，隨后進(jìn)行qRT?PCR 擴(kuò)增，具體參照SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒說明書進(jìn)行，miRNA 與REG3A 分別以U6、β?actin 作為內(nèi)參。以2?ΔΔCt法計(jì)算基因mRNA 相對(duì)表達(dá)水平，各引物序列見表1。

表1 各基因引物序列Tab.1 Primer sequence of each gene

1.3.3 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染在A549 細(xì)胞中添加含10%胎牛血清、1%青?鏈霉素雙抗的DMEM 完全培養(yǎng)液，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，匯合度達(dá)到70%時(shí)，進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作。實(shí)驗(yàn)分為5 組，包括miR?137 NC 組、miR?137 mimic 組、miR?342?3p NC 組、miR?342?3p mimic 組，并選擇正常A549 細(xì)胞作為空白對(duì)照組。按照Lipofectamine 2000 說明書進(jìn)行操作，轉(zhuǎn)染4 h 后更換為新鮮完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)研究。

1.3.4 Western blotRIPA 裂解液提取各組細(xì)胞總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)量。取等量各蛋白樣品加到10%SDS?PAGE 凝膠孔，經(jīng)電泳分離后，對(duì)目的蛋白區(qū)域切膠，電轉(zhuǎn)至PVDF 膜，5%脫脂奶粉封閉2 h。TBST 洗膜，加入一抗，4 ℃下共孵育過夜。次日，TBST 洗膜，加入對(duì)應(yīng)二抗，室溫孵育1 h，TBST 洗膜，ECL 顯影，凝膠成像系統(tǒng)拍照，Image Pro?Plus 系統(tǒng)分析各蛋白條帶灰度值。

1.3.5 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)Target Scan軟件預(yù)測(cè)miR?137、miR?342?3p 與REG3A 3'?UTR 是否存在結(jié)合位點(diǎn)。根據(jù)靶位點(diǎn)序列設(shè)計(jì)所需的啟動(dòng)子片段，構(gòu)建WT?REG3A 3'?UTR 和MUT?REG3A 3'?UTR 質(zhì)粒載體。將A549 細(xì)胞以1×105個(gè)/孔接種于24 孔板，使用Lipofactamine 2000 分別將miR?137 mimic、miR?342?3p mimic 或?qū)?yīng)陰性對(duì)照聯(lián)合構(gòu)建好的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染至細(xì)胞，根據(jù)雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒操作說明書操作檢測(cè)各組細(xì)胞熒光素酶活性。

1.3.6 CCK?8法收集各組A549細(xì)胞，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，分別于24、48、72、96 h時(shí)，在各孔加入10 μL CCK?8，混勻后繼續(xù)培養(yǎng)2 h，通過酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定450 nm處吸光度值。

1.3.7 EdU染色將各組A549細(xì)胞以1×105個(gè)/孔接種于24 孔板中，過夜培養(yǎng)后，換用含10 μmol/L EdU 處理2 h，PBS 洗滌，4%多聚甲醛固定30 min，甘氨酸處理5 min，0.5%Triton X?100再處理10 min，洗滌后，加Apollo567 避光孵育30 min，再以DAPI避光孵育30 min，洗滌后封片，晾干，通過激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞染色情況，隨機(jī)選擇5 個(gè)視野，計(jì)數(shù)該視野下總細(xì)胞數(shù)目與EdU 標(biāo)記陽性細(xì)胞數(shù)目，計(jì)算EdU+陽性率。

1.3.8 Annexin V?FITC/7?AAD 雙染法使用胰酶消化各組A549 細(xì)胞，PBS 洗滌，用適量1×bind?ing buffer 重懸，調(diào)整密度為1×106個(gè)/mL，吸取100 μL懸液，依次加入5 μL Annexin V?FITC與5 μL 7?AAD，室溫避光孵育15 min，再用200 μL 1×bind?ing buffer 重懸，立即通過流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)細(xì)胞凋亡百分比。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法SPSS 23.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間數(shù)據(jù)比較采用LSD?t檢驗(yàn)；以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miRNA在重癥肺炎患兒和健康兒童中的表達(dá)比較重癥肺炎患兒血清中miR?425?5p、miR?137、miR?325?3p、miR?342?3p、miR?203a?3p 及miR?9?3p相對(duì)表達(dá)量均高于健康兒童（P<0.05），見圖1。其中miR?137 和miR?342?3p 相對(duì)表達(dá)量分別呈高、低表達(dá)。

圖1 重癥肺炎患兒和健康兒童血清中miRNA 表達(dá)檢測(cè)Fig.1 Detection of miRNA expression in the serum of children with severe pneumonia and healthy children

2.2 REG3A 在重癥肺炎患兒和健康兒童中的表達(dá)比較經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，REG3A 的mRNA 相對(duì)表達(dá)量在重癥肺炎患兒血清中低于健康兒童血清（P<0.05），見圖2。

圖2 重癥肺炎患兒和健康兒童血清中REG3A mRNA 表達(dá)比較Fig.2 Comparison of REG3A mRNA expression in serum between children with severe pneumonia and healthy children

2.3 miR?137、miR?342?3p 與REG3A 的靶向關(guān)系檢測(cè)經(jīng)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)miR?137 與REG3A 3'?UTR 以及miR?342?3p 與REG3A 3'?UTR 均在特定區(qū)域存在堿基互補(bǔ)現(xiàn)象，見圖3A。與miR?137 NC比較，miR?137 mimic 和WT?REG3A 3'?UTR 重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染組的相對(duì)熒光值降低（P<0.05）；與miR?342?3p NC 比較，miR?342?3p mimic 和WT?REG3A 3'?UTR重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染組的相對(duì)熒光值降低（P<0.05），見圖3B。

圖3 miR?137、miR?342?3p 與REG3A 3'?UTR 靶向關(guān)系Fig.3 Targeting relationship between miR?137，miR?342?3p and REG3A 3'?UTR

2.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后miR?137、miR?342?3p 及REG3A蛋白表達(dá)檢測(cè)miR?137 mimic 組A549 細(xì)胞中miR?137 相對(duì)表達(dá)量高于空白對(duì)照組（P<0.05），miR?342?3p mimic 組細(xì)胞miR?342?3p 相對(duì)表達(dá)量高于空白對(duì)照組，見圖4。miR?137 mimic組REG3A蛋白相對(duì)表達(dá)量較空白對(duì)照組下降（P<0.05），與空白對(duì)照組比較，miR?342?3p mimic 組REG3A 蛋白相對(duì)表達(dá)量下降（P<0.05）。見圖5。

圖4 qRT?PCR 檢測(cè)各組細(xì)胞miR?137 與miR?342?3p 表達(dá)Fig.4 qRT?PCR detection of the expression of miR?137 and miR?342?3p in each group of cells

圖5 Western blot 檢測(cè)各組細(xì)胞REG3A 蛋白表達(dá)Fig.5 Western blot detection of REG3A protein expression in each group of cells

2.5 miR?137 與miR?342?3p 高表達(dá)對(duì)肺上皮細(xì)胞增殖的影響在各檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)，miR?137 mimic組細(xì)胞活性較空白對(duì)照組均下降（P<0.05），miR?342?3p mimic組細(xì)胞活性較空白對(duì)照組下降（P<0.05），見圖6A。此外，與空白對(duì)照組比較，miR?137 mimic組EdU 陽性細(xì)胞率下降（P<0.05），miR?342?3p mimic 組EdU 陽性細(xì)胞率也較空白對(duì)照組下降（P<0.01），見圖6B。

圖6 各組細(xì)胞增殖檢測(cè)Fig.6 Cell proliferation detection in each group

2.6 miR?137 與miR?342?3p 高表達(dá)對(duì)肺上皮細(xì)胞凋亡的影響miR?137 mimic 組細(xì)胞凋亡率較空白對(duì)照組升高（P<0.05），miR?342?3p mimic 組細(xì)胞凋亡率較空白對(duì)照組升高（P<0.05），見圖7。與空白對(duì)照組比較，miR?137 mimic 組細(xì)胞Caspase?3、Bax 和p53 蛋白表達(dá)量增加，Bcl?2 蛋白表達(dá)量減少（P<0.05）；與空白對(duì)照組比較，miR?342?3p mimic組細(xì)胞Caspase?3、Bax和p53蛋白表達(dá)量增加，Bcl?2蛋白表達(dá)量減少（P<0.05），見圖8。

圖7 Annexin Ⅴ?FITC/PI 雙染法檢測(cè)各組A549 細(xì)胞凋亡Fig.7 Annexin Ⅴ?FITC/PI double staining method to detect A549 cell apoptosis in each group

圖8 Western blot 檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)Fig.8 Western blot detection of apoptosis?related protein expression in each group

3 討論

肺炎支原體感染后，人體通過免疫反應(yīng)介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，臨床表現(xiàn)為細(xì)支氣管炎、肺炎等［9-11］。多項(xiàng)研究指出miRNA 與肺部炎癥疾病密切相關(guān)，例如：缺乏miR?155 的小鼠肺支氣管肺泡中白細(xì)胞數(shù)量增加［12］；脂多糖誘導(dǎo)的肺炎小鼠肺部檢測(cè)到多個(gè)miRNA 表達(dá)異常［13］。因此，關(guān)注miRNA 在肺部炎性反應(yīng)中的調(diào)節(jié)功能有望為小兒肺炎的診斷和治療提供新方向。

本研究發(fā)現(xiàn)，在重癥肺炎患兒血清中miR?425?5p、miR?137、miR?325?3p、miR?342?3p、miR?203a?3p、miR?9?3p 的表達(dá)水平均明顯高于健康兒童，其中miR?137 的表達(dá)水平較高，miR?342?3p 的表達(dá)水平較低。已有研究表明miR?137 和miR?342?3p 參與組織損傷或炎癥性疾病的發(fā)生發(fā)展。LI 等［14］報(bào)道指出miR?137 是一種缺氧反應(yīng)基因，其過表達(dá)會(huì)加重缺氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡；ELGE?BALY 等［15］研究表明miR?137 可作為不穩(wěn)定型心絞痛患者的早期炎癥診斷的新型生物標(biāo)志物；RAY 等［16］研究表明miR?342?5p 在動(dòng)脈粥樣硬化中可誘導(dǎo)促炎介質(zhì)NOS2 和IL?6 的表達(dá)，加重炎癥反應(yīng)。本研究在肺上皮細(xì)胞中過表達(dá)miR?137 或miR?342?3p 后發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞增殖活性和EdU 陽性細(xì)胞率均下降，細(xì)胞凋亡率升高，促凋亡因子Cas?pase?3、Bax 和p53 的蛋白表達(dá)量增加，抗凋亡因子Bcl?2 蛋白表達(dá)量減少。說明miR?137 和miR?342?3p 的高表達(dá)能夠抑制肺上皮細(xì)胞增殖能力，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，提示這種異常表達(dá)現(xiàn)象可能是肺炎發(fā)生的病理機(jī)制之一。

REG3A 是REG 蛋白家族的成員，參與組織損傷修復(fù)反應(yīng)，能夠抵抗細(xì)菌在受傷部位的增殖［17］。在小鼠肺金葡菌感染后，肺上皮細(xì)胞可通過STAT3/REG3A 信號(hào)軸抵御金葡菌的入侵［18］；在糖尿病疾病中，REG3A 的異常表達(dá)會(huì)放大皮膚傷口中的炎癥，并且可能是糖尿病個(gè)體延遲傷口愈合的關(guān)鍵因素［19］。由此可見，REG3A 在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，可能參與小兒肺炎感染過程。本研究結(jié)果顯示，REG3A 在肺炎重癥患兒血清中表達(dá)降低，并通過生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)miR?137 與REG3A 3'?UTR 以及miR?342?3p 與REG3A 3'?UTR均在特定區(qū)域存在堿基互補(bǔ)現(xiàn)象，驗(yàn)證了miR?137與miR?342?3p 靶向調(diào)控REG3A 的表達(dá)，初步揭示了REG3A 的調(diào)控機(jī)制。

綜上所述，本研究表明在重癥肺炎患兒血清中miRNA 表達(dá)異常，miR?137 與miR?342?3p 的高表達(dá)可抑制肺上皮細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，其機(jī)制與靶向下調(diào)REG3A 有關(guān)，這為小兒肺炎的診斷與治療提供了新的靶點(diǎn)。但本研究僅從肺上皮細(xì)胞的體外研究出發(fā)探究了miR?137 與miR?342?3p對(duì)細(xì)胞的影響，小兒肺炎作為常見且復(fù)雜的肺部疾病，關(guān)于這兩種miRNA 在機(jī)體內(nèi)是否參與該疾病的發(fā)展以及過程中是否還涉及其他分子的參與，這均有待后續(xù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)探究。