載bpV（PIC）的神經干細胞聯合神經營養素?3殼聚糖支架參與創傷性顱腦損傷后腦神經修復的研究

李軍 管義祥 丁錦榮 劉小江 管誠

海安市人民醫院神經外科（江蘇海安 226600）

由交通事故、高空墜落等造成的創傷性顱腦損傷（traumatic brain injury，TBI）引起的神經受損會誘發多種神經并發癥，并長期影響患者的生活［1］。但是研究顯示成年人中樞神經系統損傷后難以修復，而促進神經元的再生和修復是保護TBI后神經功能的關鍵［2］。目前TBI 的臨床治療方法主要包括手術治療、藥物治療、物理療法，但效果大都不盡理想。隨著神經干細胞（neural stem cells，NSCs）移植技術的發展，給TBI 神經修復帶來了新的希望，NSCs 移植后在受損區域分化為神經元替代因損傷凋亡的宿主神經元，并且分泌多種神經營養類物質［3］。進一步的體內研究顯示，NSCs 的抑制可以促進神經元的修復和再生，但移植后的NSCs 存活率相對低，所以療效仍有欠缺，治療方法待進一步改善［4］。PTEN 蛋白在腦組織中表達，并且當PTEN 失活，會促進神經元的增殖、分化和軸突的形成［5］。牛細小病毒bpV（PIC）可在短期內強力抑制PTEN 蛋白，研究已經顯示使用bpV 處理可促進NSCs的存活，并促進NSCs的增殖和分化［6］。殼聚糖支架因具有生物降解性、低抗原性、良好的生物相容性和無熱原效應等優點，而被廣泛應用于腦組織工程中，研究顯示神經營養素3（neuro?trophin 3，NT?3）修飾的殼聚糖支架可保護神經元，并可促進對骨神經損傷的修復［7］。本研究將載bpV（PIC）的神經干細胞聯合NT?3 殼聚糖支架移植到大鼠顱腦損傷區域，探討其對受損傷的神經修復作用觀察大鼠神經功能恢復的情況。

1 材料與方法

1.1 材料和設備Sprague?Dawley（SD）雄性大鼠（SPF 級，8～10 周，270～290 g）以及孕14 d 雌性大鼠來自南通大學實驗動物中，生產許可證號：SCXK（蘇）2002?0019。SAR830/AP 呼吸機（CWE 公司，美國）。bpV（PIC）（ATCC 公司，美國）。NT?3殼聚糖支架（浙江金殼公司，中國）。莫里斯水迷宮（XR?XM101，上海新軟信息技術有限公司，中國）。HE 染色。Leica EM UC6 切片機（Leica 公司，德國）。BrdU 試劑盒（碧云天公司，中國）。

1.2 大鼠建模、分組和干預將90 只大鼠隨機分為對照組、TBI 組、TBI+NSCs 組、TBI+bpV（PIC）?NSCs 組、TBI+NT?3 殼聚糖組和TBI+bpV（PIC）?NSCs+NT?3 組（n=15）。根據參考文獻構建TBI 模型［8］，通過腹膜內注射水合氯醛（10%，3 mL/kg）麻醉大鼠，連接呼吸機，呼吸平穩后常規消毒剃毛，暴露骨窗，使用小動物顱腦撞擊器敲擊模擬中度皮層損傷。對照組大鼠僅暴露骨窗不敲擊。根據組別，在敲擊后立即植入NSCs（1×106個）、bpV（PIC）?NSCs（1×106個）、NT?3 殼聚糖（1 各單位）或者負載bpV（PIC）?NSCs 的NT?3 殼聚糖（1×106個NSCs+1 各單位）［9-10］。然后縫合傷口，注射抗生素預防感染。

1.3 負載bpV（PIC）?NSCs 的NT?3 殼聚糖支架的制備孕14 d 雌性大鼠吸入過量二氧化碳安樂死，取出胎鼠，根據參考文獻［9］構建NSCs，將腦神經組織使用胰蛋白酶37 ℃消化30 min，0.15%Ⅱ型膠原酶37 ℃、5% CO2中消化8 h 獲得原代NSCs。將NSCs 在含有10%胎牛血清的DMEM 中培養成具有干細胞特性的球狀聚集細胞團，加入10 μmol/L BrdU 標記48 h 備用。根據參考文獻［10］，取NSCs 消化后制成濃度為5×104/mL 的單細胞懸液，500 μL 細胞懸液接種在24 孔板上，每孔2.5×104個細胞。培養基中加入終濃度為200 nm 的bpV（PIC）孵育7 d。收集干細胞球，將1×106個NSCs 種植于NT?3 殼聚糖支架上，4 ℃孵育3 h，制備成負載bpV（PIC）?NSCs 的NT?3 殼聚糖支架。

1.4 檢測指標方法

1.4.1 mNSS 評分建模后3 h 和建模7 d 后通過mNSS 評分系統是評估大鼠神經功能缺損的通用標準，包括了運動、感覺、反射和平衡測試［11］。mNSS 分數最高為18 分，分數越高，神經損傷越嚴重。

1.4.2 水迷宮實驗［12］建模7 d 后進行。水迷宮注滿水，溫度控制在（25±1）℃。水池直徑為1.6 m，高度為40 cm。一個平臺隱藏在水面以下1 cm 處。第一階段（定位導航）：將小鼠依次靠墻放置在四象限水迷宮中，如果動物在90 s 內登上平臺區域，則記錄結束；如果動物在90 s 內沒有登上平臺區域，則用棍子將小鼠引導到平臺并在那里保持30 s。每只小鼠每天訓練4 次。試驗之間的間隔大于2 min。第二階段（探索）：第一至第四象限全部完成，拆除水迷宮平臺，將小鼠置于同一象限靠墻觀察動物90 s 的動作軌跡，記錄目標象限停留時間和穿越平臺次數，二者數值越低提示神經功能損傷越嚴重。

1.4.3 HE染色大鼠吸入過量二氧化碳后安樂死，取出腦組織并在室溫下用4%多聚甲醛固定6 h。用乙醇脫水（從低濃度到高濃度）后，將組織包埋在石蠟中。然后將石蠟包埋的組織切成5 μm 的切片，并將這些切片固定在載玻片上。將載玻片在室溫下放入蘇木精中染色10 min。用自來水洗滌1～2 min 后，將玻片置于10%冰醋酸中10 s，然后置于1%氨水中，直到切片變藍。隨后用自來水清洗1～2 min 后，將玻片放入曙紅中10 s。在乙醇（濃度分別為70%、90%、95%和100%）中脫水后，將玻片置于二甲苯中2 min；重復此步驟一次。最后，用中性膠密封玻片。在倒置顯微鏡下觀察。

1.4.4 BrdU 染色檢測神經元新生新增殖的細胞會利用具有綠色紅色光的BrdU 合成DNA，用4%的聚甲醛固定腦組織并用梯度醇脫水，包埋在石蠟中，制成厚度為5 μm 的組織玻片標本，根據試劑盒說明書加入100 μL 的滲透劑（PBS，0.5%TritonX?100），然后加入100 μL 的BrdU 染色反應液體。使用激光共聚焦顯微鏡觀察新生的神經元。

1.5 統計學方法統計分析使用SPSS 19 軟件，計量資料以均數±標準差表示，采用重復測量方差分析，多組間兩兩比較要采用Bonferroni 校正。P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 bpV（PIC）?NSCs 聯合NT?3 殼聚糖支架對TBI 大鼠mNSS 評分的影響建模后3 h，大鼠mNSS 評分升高且高于9 分，提示TBI 建模成功。建模后7 d，TBI+NSCs 組的mNSS 評分低于TBI 組（P<0.05）；TBI+bpV（PIC）?NSCs 組的mNSS 評分低于TBI+NSCs 組（P<0.05）；TBI+bpV（PIC）?NSCs+NT?3 組的mNSS 評分低于TBI+bpV（PIC）?NSCs 組（P<0.05）。見表1。

表1 bpv（PIC）?NSCs 聯合NT?3 殼聚糖支架對TBI 大鼠mNSS 評分的影響Tab.1 The effect of bpv（PIC）?NSCs combined with NT?3 chitosan scaffold on the mNSS score of TBI rats ±s，分

表1 bpv（PIC）?NSCs 聯合NT?3 殼聚糖支架對TBI 大鼠mNSS 評分的影響Tab.1 The effect of bpv（PIC）?NSCs combined with NT?3 chitosan scaffold on the mNSS score of TBI rats ±s，分

注：與對照組比較，aP<0.05；與TBI 組比較，bP<0.05；與TBI+NSCs組比較，cP<0.05；與TBI+TBI+NT-3殼聚糖組比較，dP<0.05

組別對照組TBI 組TBI+NSCs 組TBI+bpV（PIC）?NSCs 組TBI+NT?3 殼聚糖組TBI+bpV（PIC）?NSCs+NT?3 組F 值P 值建模后3 h 0±0 9.62±1.25a 9.58±1.31a 9.66±1.20a 9.52±1.36a 9.59±1.24a 14.058<0.001建模后7 d 0±0 9.39±1.56a 7.81±1.17ab 5.56±0.86abc 9.31±1.30a 3.12±0.54abcd 193.426<0.001

2.2 bpV（PIC）?NSCs 聯合NT?3 殼聚糖支架對TBI 大鼠神經功能的影響6 組的水迷宮實驗結果比較差異有統計學意義（P<0.05）。TBI 組的神經功能水平低于對照組（P<0.05）；TBI+NSCs 組的神經功能水平高于TBI 組（P<0.05）；TBI+bpV（PIC）?NSCs 組的神經功能水平高于TBI+NSCs 組（P<0.05）；TBI+bpV（PIC）?NSCs+NT?3 組的神經功能水平高于TBI+bpV（PIC）?NSCs組（P<0.05）。見表2。

表2 bpV（PIC）?NSCs 聯合NT?3 殼聚糖支架對TBI 大鼠神經功能的影響Tab.2 Effect of bpv（PIC）?NSCs combined with NT?3 chitosan scaffold on nerve function of TBI rats x±s

2.3 bpV（PIC）?NSCs聯合NT?3殼聚糖支架對TBI大鼠腦組織病理學的影響對照組神經元分布均勻，細胞核結構清晰。TBI 組的細胞核染色變深，細胞內出現空洞，出現間質性水腫。TBI+NSCs 組的損傷情況較TBI 組輕微改善。TBI+bpV（PIC）?NSCs 組的空洞和水腫情況顯著改善。TBI+NT?3殼聚糖組損傷情況與TBI 組相似。TBI+bpV（PIC）?NSCs+NT?3 組基本正常，優于TBI+bpV（PIC）?NSCs組。見圖1。

圖1 HE 染色檢測bpV（PIC）?NSCs 聯合NT?3 殼聚糖支架對TBI 大鼠腦組織病理學的影響（×200）Fig.1 HE staining to detect the effect of bpV（PIC）?NSCs combined with NT?3 chitosan scaffold on the pathology of brain tissue in TBI rats（×200）

2.4 bpV（PIC）?NSCs聯合NT?3殼聚糖支架對TBI大鼠腦神經元新生的影響對照組正常，有少量新生神經元。TBI組新生數量較對照組略多。TBI+NSCs 組的新生神經元顯著多于TBI 組；TBI+bpV（PIC）?NSCs 組的新生神經元顯著多于TBI+NSCs組。TBI+NT?3 殼聚糖組的新生神經元與TBI 組類似。TBI+bpV（PIC）?NSCs+NT?3 組的新生神經元顯著多于TBI+bpV（PIC）?NSCs 組。見圖2、表3。

表3 bpv（PIC）?NSCs 聯合NT?3 殼聚糖支架對TBI 大鼠腦神經元新生的影響Tab.3 The effect of bpv（PIC）?NSCs combined with NT?3 chitosan scaffold on brain neurogenesis in TBI rats ±s

表3 bpv（PIC）?NSCs 聯合NT?3 殼聚糖支架對TBI 大鼠腦神經元新生的影響Tab.3 The effect of bpv（PIC）?NSCs combined with NT?3 chitosan scaffold on brain neurogenesis in TBI rats ±s

注：與對照組比較，aP<0.05；與TBI 組比較，bP<0.05；與TBI+NSCs組比較，cP<0.05；與TBI+TBI+NT?3殼聚糖組比較，dP<0.05

組別對照組TBI 組TBI+NSCs 組TBI+bpv（PIC）?NSCs 組TBI+NT?3 殼聚糖組TBI+bpv（PIC）?NSCs+NT?3 組F 值P 值新生神經元數目3.27±0.31 8.22±0.79a 17.64±1.21ab 29.38±2.25ab 8.97±1.04a 42.05±3.52abcd 957.225<0.001

圖2 BrdU 染色檢測bpv（PIC）?NSCs 聯合NT?3 殼聚糖支架對TBI 大鼠腦神經元新生的影響（×400）Fig.2 BrdU staining detection of bpv（PIC）?NSCs combined with NT?3 chitosan scaffold on TBI rat brain neurons（×400）

3 討論

TBI 后神經功能障礙已經成為意外傷害致死的首要原因［13］。研究表明，中樞神經系統自身修復困難的原因主要在于神經營養素的缺乏和膠質疤痕的空間阻隔，研究者們圍繞上述理論進行了廣泛的應用研究，但仍未有突破性的進展。成年人中樞神經自身內在生長能力的低下是其再生困難的主因［14-15］。

現階段，研究已經證實提高自身內在生長能力的措施主要在于兩方面，一是增加損傷局部神經再生種子細胞數量，并促使其分化為神經元，二是促進和引導軸突正確生長［16］?；诖耍芯縏BI后如何提高神經功能修復以改善TBI 的預后，成為當前針對TBI 研究的焦點。NSCs 具有分化成神經元等細胞的潛能，并可分泌神經營養因子促進神經元修復，研究也證實了NSCs 移植會促進損傷修復，但是由于NSCs 移植后存活率較低，所以治療效果仍然有限［17］。PTEN 是調控神經元凋亡、增殖、更新、分化的重要蛋白，其可通過抑制PI3K/AKT 信號通路的轉導影響抑制TBI 后神經元的再生［18］，而抑制PTEN 則成為促進NSCs 存活和分化的重要策略。bpV（PIC）是一種特效的PTEN 抑制劑，并且研究已經證實，使用bpV（PIC）可抑制PTEN 并促進NSCs 在體內和體外增殖和分化［19］。為探索一種治療急性脊髓損傷的新策略，本研究培養載bpV（PIC）?NSCs 進一步提高其移植后存活率，并進一步聯合NT?3 殼聚糖支架移植到大鼠受損區域，探討其對受損傷的神經修復作用，以期為該病的臨床治療提供參考。本次研究通過外科擊打的方式構建TBI 模型，并在建模后立即植入NSE或者bpV（PIC）修飾的NSCs。結果顯示NSCs 可促進神經元再生和緩解神經元損傷，并可提高神經功能，但是其作用有限。分析認為NSCs 移植到顱腦受損區域能夠進一步分化成所需的神經細胞，實現神經回路局部重建，代償部分受損神經細胞的功能；同時移植后的NSCs 促進多種神經營養因子分泌，改善TBI 后的局部微環境，防止進一步的繼發性神經功能損害，有利于神經系統功能恢復；而bpV（PIC）修飾的NSCs 可顯著的緩解神經損傷促進神經元新生，顯著的促進神經功能的恢復，其作用顯著優于NSCs。結合文獻報道和本次研究結果，提示使用bpV（PIC）修飾抑制PTEN 后，NSCs的增殖、分化能力顯著升高，從而提高對TBI 大鼠神經的修復作用。移植后的NSCs 能否長期存活是移植治療療效的關鍵因素，既往研究多通過單純的NSCs 移植治療TBI，但移植物的長期存活率在，有5%～30%不等，具有較高的可變性。而通過培養載有bpV（PIC）的NSCs 能夠抑制PTEN 表達，有利于提高NSCs 在體內的長期存活率，進而保障更多的神經細胞增殖和分化，而分化后的NSCs 通過表達一些神經遞質的受體，促進神經功能恢復。

為進一步體改NSCs 的存活提高治療結果，本研究也利用NT?3 殼聚糖支架來負載NSCs。殼聚糖是一種天然生物聚合物，在結構上類似于糖胺聚糖。殼聚糖具有高度的生物相容性和可生物降解性，沒有毒性作用，并具有抑菌性，是最受青睞的軟骨、神經等再生生物材料之一［20］，也是負載干細胞和維持干細胞存活的重要生物材料［21］。研究顯示，使用NT?3 修飾后的殼聚糖能夠為NSCs 提供營養，并促進NSCs 的存活，并在體內促進NSCs 修復神經元損傷的功能［22］。殼聚糖支架的多孔三維立體結構能夠為移植的細胞提供了生長、營養代謝、分泌排泄、氣體交換提供良好的場所，同時也為分化后神經細胞、新生神經組織提供了必要的結構基礎，為軸突的生長提供了支架幫助神經元突起與宿主腦組織建立突觸聯系。本此研究結果顯示，單獨使用NT?3 殼聚糖支架對TBI 大鼠的神經功能沒有明顯的保護作用，但是與單獨的bpV（PIC）?NSCs 比較，bpV（PIC）?NSCs 聯合NT?3 殼聚糖支架可更加顯著的恢復神經元損傷，促進神經元再生，并恢復大鼠的神經功能。根據過往文獻報道和本次研究結果，提示NT?3 殼聚糖支架會進一步促進bpV（PIC）?NSCs 對TBI 后神經功能的修復。

然而，本研究僅為定性實驗，關于bpV（PIC）?NSCs 聯合NT?3 殼聚糖支架的有效性和安全性仍需要深入研究，其分子機制需要全面的、深入的分析，此外如何實現移植后更多的分化神經元還需要進一步的干預研究，關于移植bpV（PIC）?NSCs聯合NT?3 殼聚糖支架后局部微環境改善相關營養因子的分泌釋放需要進一步的免疫熒光標記來驗證。

綜上所述，聯合bpV（PIC）?NSCs 聯合NT?3 殼聚糖支架可顯著的促進TBI 大鼠的神經修復，可能成為治療TBI 和改善患者預后的新方法。