基于2b-RAD基因測序技術遺傳圖譜構建和QTL定位

高 杰

（河北農業大學海洋學院，中國水產科學研究院南海水產研究所）

簡化基因組測序(Reduced-representation sequencing)是一種從第二代測序發展而來的測序技術，利用實驗手段，如酶解，降低物種基因組的復雜性，對基因組的特定區域進行測序以反映結構信息的測序技術。

通常簡化基因組測序，是指利用限制性內切酶對基因組DNA進行裂解，并分離出其中的某些特征片段，利用二代測序技術，可以用于全基因組遺傳標記的開發和分型。利用簡化的基因組測序技術進行大規模高通量SNP分型是目前國際上動植物基因組學研究的趨勢。

使用時間最長的簡單基因組分析技術是由美國Oregon大學發明的限制性位點關聯DNA（RAD）技術。 然而，RAD技術有兩大技術缺陷：繁瑣的文庫構建過程，涉及多輪的DNA分離和純化，嚴重影響了技術的可重復性和可靠性；RAD技術產生的DNA具有不同長度的限制性片段，但PCR技術本身具有對圖案的長度有偏好（即優先擴增較小的DNA片段）。而文庫構建階段的PCR和測序階段的emulsionPCR，會嚴重影響擴增DNA片段的基因組代表性。

2b-RAD技術有效地克服了上述RAD技術的固有缺點。它使用IIB型限制性內切酶，通過全基因組消化產生33-36bp的等長標記，這些標記被富集并用于下游的高通量測序反應，通過生物信息分析進行高通量全基因組SNP篩選和分型分析。

1 簡化基因組技術介紹

隨著信息技術的不斷提升，從2008年至今已經發展出至少以下7種簡化基因組測序技術。

表1 簡化基因測序技術發展順序

技術名稱 出現年份2b-RAD(IIB restriction sit e Associated DNA) [4] 2012 年SLAF（specific-locus amplified fragment sequencing) [5] 2013 年Multi-isoRAD（2b-RAD 升級版）[6] 2016 年Super-GBS（GBS 改進版）[7] 2018 年

2 2b-RAD技術

針對RAD技術的一系列缺點，2012年Wang等推出基于IIB型限制性內切酶的2b-RAD技術。其核心是IIB型限制性內切酶的應用。將適合于高通量測序平臺的接頭連接于標簽兩側后，再經過PCR擴增，即可上機進行測序。

2.1 技術特點

與其他測序技術相比2b-RAD技術優勢更加明顯，如表2。其所有酶切片段都用于測序，避免了像其他RAD技術那樣，必須經過片段選擇而導致部分信息的損失；目前已經成功實現嚴重降解的中華絨螯蟹、中國對蝦、等樣品的建庫測序[8]；如果DNA量非常少，常規情況下無法開展個體水平的研究，2b-RAD對1-10ng級的DNA依然可建庫成功。

表2 常用簡化基因組測序技術比較

2.2 遺傳圖譜和 QTL定位

遺傳圖譜（genetic map）又叫連鎖圖譜（linkage map），是根據重組率估算出來的基因或遺傳標記在染色體上相對位置的線性排列圖。遺傳圖譜的構建就是用重組率來表示基因的遺傳距離，圖距單位用厘摩（Centi-Morgan，cM）表示，1cM的大小大致表示1%的重組率。

QTL（數量性狀基因座）定位是指控制數量性狀的基因在基因組中的位置，是利用數理統計的方案，分析整個基因組DNA分子標記和數量性狀表型值的關系。

利用2b-RAD技術，對某物種合適的作圖群體進行測序，獲得酶切位點附近的基因序列信息，運用生物信息學方法開發SNP，并計算標記間的遺傳連鎖距離，繪制連鎖圖譜，可用于后續QTL定位、輔助基因組組裝等方向的分析。能夠降低基因組的復雜度，數據量低，操作簡便，節約成本，特別適合大樣本量的研究。

3 結語

隨著科學技術的發展基因測序技術也取得了一定的成就，2b-RAD技術具有信息全面、重復性好不受PCR偏好性影響等優點，其為我們更加深層次和更快捷了解物種某一性狀提供了理論依據和技術手段。此技術的完善與發展將為未來基因測序提供了新的技術支持，推動簡化基因技術進一步地發展。