井岡霉素的發酵配方優化研究

周海平 錢江偉

摘要：以現有的井岡霉素工業生產菌種S#菌株為研究對象，在現有生產配方的基礎上，調整發酵碳、氮源品種和配比，在設備、種齡、種量、空氣流量等工藝條件相同的情況下，通過搖瓶和中試罐試驗，根據試驗實測值，探究井岡霉素工業生產的最佳碳、氮源原料與配比，實現生產配方的優化。

關鍵詞：井岡霉素;種子;發酵配方;優化

井岡霉素是通過吸水鏈霉菌井岡變種發酵產生的一種多元混和物，有效成分為井岡霉素A[1]，主要用于防治水稻、小麥紋枯病和棉花、蔬菜、豆類等農作物的立枯病以及葡萄等果樹的黑粉病等，是我國迄今為止應用最早、使用最廣的廉價高效農用抗生素藥物，深受農戶歡迎[2]。近年來，井岡霉素在其他領域（如醫藥等）也有廣泛的應用，井岡霉素的生物合成中間體是制造治療糖尿病藥物的原料之一，經濟價值很高[3]。為了迎合市場需求，研究生物合成井岡霉素生產配方優化，提高井岡霉素發酵水平，降低成本，提高經濟效益。

1 試驗

1.1 設備與試劑

S#菌株斜面種子、天門冬氨酸、大米粉（80目）、酵母粉、玉米粉、黃豆粉（60目）、花生粉（60目）、氨基酸粉（60目）、棉籽粉（60目）、蠶蛹粉（60目）、磷酸氫二鉀（工業級）、氯化鈉（工業級）、氫氧化鈉（工業級）、消泡劑（工業級）、恒溫振蕩培養箱（SPH-2110）、三角瓶（500 mL）、種子罐（1000 L）、發酵罐（1000 L）、生物顯微鏡、酸度計、液相色譜儀。

1.2 種子配方優化

1.2.1 種子試驗配方

以搖瓶試驗方式篩選最佳種子配方[4]，以生產配方為基礎，以大米為主碳源，探究玉米粉對發酵的影響，同時，探究氮源種類、配比不同的種子培養基配方對發酵水平的影響，采用正交試驗，各組種子培養基按表1配制。

搖瓶發酵配方：米粉8.00 %，酵母粉0.50%，黃豆粉1.50%，花生粉1.50%，棉籽粉0.50%，氯化鈉0.20%，磷酸氫二鉀0.02%。 1.2.2 試驗步驟

按上述配方中的原料種類和比例配制培養基，用20.00%氫氧化鈉溶液將pH調至7.5，分裝至500 mL三角瓶中，裝量為60 mL，用棉塞加牛皮紙進行環繞式封口，立即用滅菌鍋高溫（120 ℃）消毒30 min，自然冷卻備用。在無菌條件下，將50 mL無菌水倒入S#菌株斜面種子瓶中，用竹簽刮下菌落搗碎搖勻后，用無菌移液管，對種子瓶進行接種，每個種子瓶的接種量為5 mL，用8層紗布封口，放至SPH-2110恒溫振蕩培養箱培養，轉速為240 r/min，37℃ 培養20～30 h，跟蹤菌絲掛壁狀態，鏡檢菌體生長的形態，判斷種子成熟時機。種子成熟后迅速接入預先準備好的無菌發酵搖瓶，接種量為5.00%，用8層紗布封口，每組2個放至 SPH-2110恒溫振蕩培養箱培養，轉速為240 r/min，40℃培養92 h后取濾液，用液相色譜儀檢測井岡霉素A組分含量。

1.3 發酵配方優化

考慮搖瓶試驗條件與大生產條件存在一定的差異，中試罐的發酵條件與大生產發酵罐的條件更加接近，所以將發酵配方優化試驗放在中試罐上進行[5]。以大生產配方為基礎，探究主要碳源大米粉配比不同和氮源種類不同、配比不同對發酵水平的影響，采用正交試驗，發酵培養基按表2配制。

1.3.1 發酵試驗配方

從搖瓶種子配方的試驗結果中選取最佳配方作為發酵配方中試試驗的種子罐配方（見表2）。其他統一按氯化鈉0.20%、磷酸氫二鉀0.02%、消泡劑0.03%配比。

1.3.2 試驗步驟

每批投料前對種子罐、發酵罐及各個閥門進行清潔和檢查，防止染菌。種子罐按400 L計料、350 L定容，發酵罐按6000 L計料、5 000 L定容，先投碳、氮源， pH調到7.5，投入無機鹽消泡劑，123 ℃蒸汽滅菌30 min，冷卻至培養溫度，每個種子罐接入1個斜面種子瓶。種子罐培養條件：37 ℃恒溫，通氣量為1.0∶1.0，攪拌轉速為240 r/min，培養時間為20～30 h，種子罐移種前要鏡檢，確保沒有雜菌，種子生長成熟才可以移入發酵罐進行培養，移種量控制在5.00%。發酵罐培養條件：40℃恒溫，通氣量為1.0∶1.2，攪拌轉速為180 r/min，培養80 h后取濾液，用液相色譜儀檢測井岡霉素A組分含量。

2 結果討論

2.1 種子培養基配方對發酵水平的影響

影響發酵水平的因素除了發酵過程控制外，最重要的是種子質量的控制。在種子培養過程中，中間控制環節往往相對簡單，影響最大的還是培養基原料的選擇。種子培養基原料的選擇一般首先要求原料質量穩定，既有利于菌絲的快速生長，又要保證每批種子生長穩定、產素能力高，確保移入大罐后穩產、高產。按表1試驗方案得到試驗結果如表3所示。

從表3的試驗數據得出，用搖瓶試驗篩選最佳種子配方。 A2種子配方：大米粉3.00%，花生粉2.00%，酵母粉0.50%，蠶蛹粉0.50%。在相同的培養條件下，種子生長較其他配方快2～4 h，發酵效價提高3.58%～20.16%，較實際大生產配方提高3.58%，為最佳配方。另外，碳源用大米粉較玉米粉生長更快，發酵效價提高13.55%;氮源用花生粉優于黃豆粉，蠶蛹粉雖然用量不大，但明顯有利于提高發酵效價。? 2.2發酵培養基配方對效價的影響

發酵培養基原料的選擇不僅要考慮生產水平的高低、原料的單位消耗、能耗、原料的易得程度和加工難度，還要考慮對后道提取的影響和產品的質量，但最核心的還是綜合經濟效益。發酵培養基配方中試優化試驗在種子配方優化后得出結論，選擇A2種子配方按表2的試驗方案進行，試驗檢測結果如表4所示。

從表4的試驗數據可知，在A 2種子配方條件下，發酵培養基B8配方（大米粉10.00%，花生粉1.00%，棉籽粉1.00%，黃豆粉1.00%，酵母粉0.50%，蠶蛹粉1.00%）的發酵效價最高，比其他試驗配方高2.43%～12.75%，較大生產配方提高12.75%。另外，碳源用大米粉從8.00%提高到10.00%，發酵效價平均提高7.75%，效果明顯;在大米粉配比相同的情況下，配方中含蠶蛹粉的發酵效價較高。

3 結語

通過對井岡霉素種子配方的搖瓶優化正交試驗、發酵配方中試優化試驗，篩選到的A2種子配方和B8發酵配方效價比實際大生產配方分別提高了3.58%和13.55%，如果能在大生產中推廣并達到中試效果，預計至少能為企業增效500萬元。

[參考文獻]

[1]徐利劍，趙維，曹聰，等.井岡霉素的研究進展[J].中國農學通報，2015（22）：191-198.

[2]謝麗媛，尹文兵，李偉，等.白僵菌天然產物及其藥理活性和生物合成研究進展[J].天然產物研究與開發，2021（1）：150-164.

[3]沈寅初.井岡霉素開發研究25年[J].植物保護，1996（4）：44-45.

[4]郭文燦，鐘世華，黃葉菊.井岡霉素生產工藝優化研究[J].精細化工中間體，2006（2）：3.

[5]王蘋，吳佳文，張海波，等.我國防治小麥赤霉病的藥劑種類評析[J].中國植保導刊，2021（1）：7.