血液MMP-9熒光免疫檢測試劑盒的研究開發

劉冰 錢珊珊 李亞楠 顧敏 白植昊

摘要：目的：基于熒光定量免疫層析技術，基質金屬蛋白酶-9（matrixmetalloproteninase-9，MMP-9）定量檢測試劑盒。[方法]采用雙抗體夾心法，檢測人血中的MMP-9活性水平。[結果]該方法的靈敏度為4.0 ng/mL，線性范圍為5.0?500 ng/mL，批內變異系數為9.94%?15.39%，批間變異系數為11.0%?16.6%，相對偏差小于10%， 測試結果顯示該試劑相關系數r>0.98，具有好的相關性。[結論]建立一種操作簡便，靈敏度高，有良好準確性和重復性，線性范圍較寬，滿足臨床檢驗需求的基質金屬蛋白酶-9檢測試劑盒。

關鍵詞：基質金屬蛋白酶-9（matrixmetalloproteninase-9，MMP-9）;熒光免疫層析技術;試劑盒

MMP-9，屬于基質金屬蛋白酶超家族成員中明膠酶的一種，是人體內最重要的蛋白酶之一。其活性水平與多種心血管疾病診斷、慢性阻塞性肺疾病、惡性腫瘤、食管癌、胃癌、肺癌、宮頸癌、膀胱癌等預后判斷等有明確相關性。可以通過血液MMP-9活性水平評估以上類疾病發生概率及惡化程度，在疾病發展中起到重要的作用[1-3]。

1材料與方法

1.1儀器和試劑

1）主要原材料：MMP-9包被用單克隆抗體，北新化成生物科技有限公司;MMP-9標記用單克隆抗體，北京萬域美瀾生物科技有限公司;羊抗鼠IgG，洛陽市佰泰科生物技術有限公司;時間分辨熒光微球，Bangs Lab公司;MMP-9純化抗原，桂林英美特生物技術有限公司;NC膜，型號HF135，美國Milipore公司;其它化學試劑為分析純或者化學純。2）三維平面點膜噴金儀，上海金標生物科技有限公司;熒光免疫分析儀，為廣州藍勃生物科技有限公司提供。3）臨床樣本：佛山市順德區北涪醫院提供。

1.2方法

1.2.1時間分辨熒光抗體結合墊制備

將時間分辨熒光微球取出置于離心管中，離心（18000 rpm ） 60min，棄上清，加入0.05 M MES （pH 6.0 ）清洗兩遍。加入EDC/NHS與室溫震蕩活化4h后，離心（18000 rpm ） 60 min，加入0.01 M PB （ pH 7.0 ）將微球重懸，按1mg微球標記0.2 mg抗體的比例加入相應抗體。室溫震蕩偶聯反應2h，加入0.5%的BSA室溫震蕩封閉2h后，開始離心（10000 rpm ） 60 min， 棄上清，加入含0.5%BSA的0.01 MPBS，2?8 °C保存備用。將標記好的抗體 稀釋成0.5 mg/mL，使用三維平面點膜噴金儀噴膜到 結合墊（4ul/cm）上，37Y干燥5h，制成時間分辨熒光抗體結合墊，于濕度為RH30%?40%的環境下保存備用。

1.2.2包被抗體NC膜制備

用含0.5%乙醇胺的0.01 M PBS將MMP-9包被抗體配成0.5mg/mL，然后使用三維平面點膜噴金儀將其按1-5ul/cm進行包被，同時包被1.5mg/mL的羊抗鼠IgG，將NC膜于37Y干燥5h，于濕度為RH30%?40%的環境下保存備用。

1.2.3試劑卡組裝

將準備好的吸水紙、樣品墊、PVC底板、試劑卡殼等包裝材料在濕度為RH30%?40%的環境下進行組裝，并切成小條（寬3.8mm/條），將試劑條裝入試劑卡殼中，井壓殼制成檢測的試劑卡。放入鋁箔袋中，加入干燥劑，密封后與2?8Y保存備用。

1.2.4內置標準曲線制備

將MMP-9使用QuikRead go檢測系統進行定標，并經MMP-9國際校準物質進行校準后，配置成5.0、10.0、30.0、50.0、100.0、300.0、500ng/mL的內部校準品，用制備好的試劑卡檢測，利用時間分辨熒光免疫分析儀進行判讀，記錄檢測的信號。將濃度與檢測信號按最小二乘法進行擬合曲線，再將擬合好的曲線參數錄入到時間分辨熒光免疫分析儀中，成為內置標準曲線。

1.2.5樣本檢測

取10uL全血或者5uL血漿樣本，加入到2mL的樣品稀釋液中，充分混勻后，取80ul混合液滴入到試劑卡樣品孔中，室溫下反應5min后，用時間分辨熒光免疫分析儀判讀結果。

1.2.6性能評估

分別使用MMP-9內部校準品、含干擾物的樣品等對試劑卡進行檢測，按照《體外診斷試劑分析性能評估系列指導原則（征求意見稿）》評估檢測系統的分析靈敏度、線性 范圍、精密度、準確度、特異性及其穩定性。

1.2.7統計學方法

檢測數據使用SPSS17.0等統計軟件進行配對卡方檢驗、Kappa一致性分析、線性回歸和Bland- Altman等分析考核試劑的相關性、一致性。同時檢測來自同一病人全血/血漿樣品各40份，考核試劑卡對不同標本的檢測能力。

2.結果

2.1標準曲線制作

用內部校準品進行測試，每個濃度測試10次，剔除離群值后取平均值。標準曲線線性范圍為5.0?500ng/mL，標準曲線具有良好的線性范圍和相關性（r>0.98 ） 。

2.2分析靈敏度

以0、3.0、4.0、5.0、6.0ng/mL的內部標準品各測定20次，以變異系數接近20%的最低濃度作為試劑盒的分析靈敏度，結果如表1。表明該試劑盒的分析靈敏度為4.0 ng/mL。

2.3精密度

選擇高（300.0 ng/mL）、中（100 ng/mL）、低 （10.0 ng/mL ）三個濃度的標準品進行精密考察，共考察了3批產品，結果如表2。表明該試劑盒的批內精密度<15%，批間精密度<20%，符合要求。

2.4特異性

選擇10ng/mL的標準品濃度，分別在里面添加如表3中的物質及其濃度，考察干擾物質對檢測結果的影響，結果如表3所示。表明干擾物質對接觸結果影響甚微，偏差<10%，符合要求。

3討論

1）本試劑盒采用的主要原材料均為國產優質原材料，大幅降低了企業的生產成本，同時也能為客 戶提供優質的產品。配合本公司的快速時間分辨熒光免疫分析儀使用，能為患者現場提供快速、準確的結果，特別適合中小型醫療衛生機構，方便普通民眾的檢測需求。

2）本試劑盒利用時間分辨熒光微球標記抗體技術，結合固相層析技術，采用雙抗體夾心法原理，MMP-9單克隆抗體標記時間分辨熒光物質（熒光信號示蹤），通過時間分辨熒光免疫分析儀俘獲檢測區域（T區）被激發的熒光信號，通過檢測區域/質控區域的值與分析物的不同濃度獲得定標曲線，實現人全血/血漿中的MMP-9定量檢測。

3）與一般的熒光物質標記不同，該方法采用了高熒光強度的時間分辨熒光微球進行標記，通過優化標記過程的每一個細節，使檢測試劑盒具有靈敏度高、檢測樣本用量少，檢測結果快速、準確、重復性好，保存有效期長的特點。

4）本研究對試劑盒的精密度、靈敏度、線性范圍和偏倚進行了分析和評估，并與進口試劑進行對比分析，兩者具有良好的相關性，比較差異無統計學意義（P>0.05 ），能夠滿足臨床的檢驗需求。

5）本研發過程采用了企業與醫療機構聯合研發的模式，在確保研發質量的同時，能提高了研發效率，縮短研發周期，節省時間成本。

參考文獻：

[1]呂錦.基質金屬蛋白酶9（MMP-9）的研究及臨床應用進展[J].醫學信息，2016，29（21）：16-17.

[2]蘇學文，朱華. 基質金屬蛋白酶-9在心血管疾病中的研究進展[J]. 內蒙古醫學雜志， 2013，45（4）： 457-459.

[3]李宏麗. 慢性心力衰竭患者血清基質金屬蛋白酶-9的變化[J]. 臨床研究，2020，50：45