軍曹魚dnd基因cDNA克隆及其在性腺周年發育過程中的表達*

鄺杰華 馬 騫,2① 陳 剛,2① 毛非凡 周啟苓 黃建盛,2 施 鋼 張健東,2

軍曹魚基因cDNA克隆及其在性腺周年發育過程中的表達*

鄺杰華1馬 騫1,2①陳 剛1,2①毛非凡1周啟苓1黃建盛1,2施 鋼1張健東1,2

(1. 廣東海洋大學水產學院 廣東 湛江 524025；2. 南方海洋科學與工程廣東省實驗室(湛江) 廣東 湛江 524025)

軍曹魚；；基因克隆；性腺發育；表達分析

基因最初鑒定于斑馬魚()中(Weidinger, 2003)，可編碼一種進化上保守的RNA結合蛋白，作為脊椎動物生殖質的重要組分之一，特異表達于生殖系細胞中，并在生殖細胞的發生及發育過程中發揮著重要作用(Gross-Thebing, 2017)。基于此特性，基因常作為分子標記物，廣泛應用于魚類生殖細胞的相關研究(程琳等, 2020)。目前，已在多種脊椎動物中克隆和鑒定出的同源基因，包括小鼠() (Bhattacharya, 2007)、紅原雞() (Aramaki, 2009)、非洲爪蟾() (Horvay, 2006)、大西洋鱈魚() (?kugor, 2014)、大西洋鮭() (Wargelius, 2016)、泥鰍() (Fujimoto, 2010)、銀鯽() (Li, 2016)等。

據報道，基因的表達模式在不同物種中存在明顯的差異，如基因僅在小鼠精巢中特異表達(Bhattacharya, 2007)；在非洲爪蟾中，基因則特異表達于卵巢(Horvay, 2006)；而大黃魚() (陳仕海等, 2015)、大菱鲆() (Lin, 2013)和牙鲆() (Wang, 2015)基因均在性腺中特異表達，但在卵巢中的表達水平要高于精巢。關于基因功能方面，小鼠基因發生突變后，將抑制原始生殖細胞(PGCs)的產生，導致部分特定遺傳背景的個體產生睪丸生殖細胞瘤(Youngren, 2005)；抑制非洲爪蟾胚胎發育時期基因的表達將直接導致其PGCs的缺失(Horvay, 2006)；敲除斑馬魚基因可引起PGCs的遷移發生異常，隨后調亡，部分雌性個體甚至出現性逆轉的現象(Weidinger, 2003)。以上研究結果表明，基因在PGCs發生、遷移及性別分化中發揮著重要的調節作用。

軍曹魚()隸屬鱸形目(Perciformes)、軍曹魚科(Rachycentridae)、軍曹魚屬()，為廣鹽暖水性海水魚類，俗稱海鱺、海龍魚，廣泛分布于熱帶和亞熱帶海域(東太平洋除外) (Castellanos-Galindo, 2016)，在中國南海部分海域亦有少量分布(陳剛等, 2004)。由于軍曹魚具有生長速率快、易于馴化、抗病力強、肉厚質地細膩等特點(Hamilton, 2013)，近年來在南方沿海地區的養殖發展迅猛，隨著人工繁殖和大規模育苗技術的突破，軍曹魚已成為我國極具前景的海水網箱養殖魚類之一。

本研究克隆分析軍曹魚()基因cDNA全長序列，利用半定量RT-PCR和實時熒光定量PCR技術(qRT-PCR)檢測的組織表達分布及其在不同發育期性腺組織中的表達水平，利用原位雜交技術初步分析mRNA在配子形成過程中的表達定位分布，旨在從分子水平闡明基因在軍曹魚配子發生過程中的作用，同時也為進一步研究魚類PGCs發生、遷移和分化的分子機理提供基礎理論資料。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及處理

實驗用軍曹魚于2019年6月—2020年4月采自廣東省茂名市電白縣某室內養殖基地，軍曹魚幼魚飼養于直徑9 m、水深2.5 m的金屬圓形水池內，流水充氣，養殖鹽度27.0～30.5，溫度25.0℃～30.0℃，分別對90、120、150、185、210和360 dph體質良好的軍曹魚進行采樣，其中，實驗用雌魚共23尾，體重215.0～5050.0 g，體長29.8～68.5 cm；雄魚共18尾，體重230.0～4225.0 g，體長29.2～64.5 cm。

對隨機采集的軍曹魚活體進行形態學指標的測量，隨后立即解剖，取出性腺，鑒定其性別，將同一尾魚的兩葉性腺分開保存，其中一葉性腺于4℃在RNA Later中靜置過夜，最后轉移至–80℃超低溫冰箱保存，用于qRT-PCR實驗；另外一葉性腺從中間剪為兩段，分別放入4%多聚甲醛(PFA)中，固定24 h后轉入焦碳酸二乙酯(DEPC)配制的70%乙醇中，用于切片原位雜交實驗。此外，選取150 dph軍曹魚雌雄各1尾，將其腦、肌肉、鰓、肝、腸、胃、脾、體腎、心、皮膚、眼睛、精巢和卵巢分離，經DEPC水沖洗后放入RNA Later中，–80℃保存待用。

1.2 Rcdnd基因全長cDNA的克隆

將采集的軍曹魚卵巢放入液氮中研磨，采用Trizol法(Invitrogen)提取總RNA。通過SimpliNano超微量核酸蛋白測定儀檢測總RNA的濃度和純度，并以1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性。參考EasyScript One-step cDNA Synthesis試劑盒(TransGen)說明書，將2 μg總RNA反轉錄合成第一鏈cDNA，另取2 μg總RNA，按照SMARTer?RACE 5′/3′試劑盒(Clontech)說明書，合成5′/3′ RACE-Ready cDNA。

從課題組前期獲得的軍曹魚全基因組數據庫(暫未上傳至NCBI數據庫)中提取基因的CDS序列信息，分別在序列兩端設計上下游特異性引物Rcdnd-F和Rcdnd-R(表1)，PCR反應條件：95℃ 5 min；95℃ 30 s，67℃ 30 s，72℃ 1 min 20 s，共35個循環；72℃ 10 min，PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，確定為目的片段后用膠回收試劑盒(TransGen)純化回收，并將純化產物連接到pMD-18T (TaKaRa)載體，進而轉化至DH-5α感受態細胞，篩選挑取單克隆陽性菌落由生工生物工程(上海)股份有限公司測序。根據測序片段，分別在靠近序列5′和3′末端各設計2條RACE引物Rcdnd 5′-R1/R2和Rcdnd 3′-F1/F2 (表1)，采用巢式PCR獲取基因5′和3′末端序列。

使用NCBI數據庫上的BLASTP對克隆所得Rcdnd氨基酸序列進行比對，下載其他硬骨魚類及高等脊椎動物的dnd氨基酸序列，利用GenDoc進行氨基酸序列多重比對分析。利用MEGA 5.0軟件，以鄰接法(neighbour-joining, NJ)構建系統進化樹，針對進化樹各分支結點均進行1000次重復計算檢驗。

1.3 Rcvasa基因在各組織及性腺發育過程中的表達

通過組織學觀察并參照國內學者(劉筠, 1993)對魚類性腺的分期方法，依據性腺中生殖細胞的種類、成熟度、數量占比及排列方式進行發育分期的劃分，提取不同發育時期軍曹魚的性腺以及150 dph軍曹魚個體各組織的總RNA，按照反轉錄試劑盒說明書合成cDNA。基于測序獲得的基因序列，設計一對特異性擴增引物Rcdnd-F1/R1，并以軍曹魚作為內參基因(表1)。PCR反應條件：94℃ 5 min；94℃ 30 s，62℃ 30 s，72 ℃ 20 s，35個循環；72℃ 10 min。通過瓊脂糖凝膠電泳檢測在不同組織中的半定量RT-PCR結果，利用Tanon 4100凝膠成像系統采集圖像。qRT-PCR實驗流程按照SYBR?Premix ExTM試劑盒(TaKaRa)說明書進行操作，使用ABI 7500型實時熒光定量PCR儀檢測在不同發育時期精巢和卵巢中的表達，每個實驗樣品設置3個重復。根據測得的值，采用2–ΔΔCt法(Schmittgen, 2008)計算的相對表達量。所得數據結果均以平均值±標準差(Mean±SD,=3)表示，利用統計學軟件SPSS 19.0進行單因素方差分析(one-way ANOVA)及Duncan′s多重比較，<0.05表示有顯著性差異。

1.4 性腺組織原位雜交

根據已獲得的基因序列，利用Primer Premier 6.0軟件設計具有特異性的寡核苷酸探針序列(表1)，探針的5′和3′端用地高辛(DIG)標記，由武漢賽維爾生物科技有限公司合成。

將石蠟包埋的120、210和360 dph軍曹魚精巢和卵巢樣品進行組織切片(5～6 μm)，具體雜交過程綜合參考相關研究中的方法(李曉妮等, 2017; 史寶等, 2017)。滴加BCIP/NBT顯色液進行化學顯色，顯微觀察陽性后再滴加核固紅染核，中性樹膠封片，最后顯微鏡檢，采集圖像分析。

表1 本研究所用引物

Tab.1 Primers used in this study

2 結果與分析

2.1 Rcdnd cDNA全長及序列分析

圖1 軍曹魚dnd cDNA全長序列和氨基酸序列分析

下劃線指示起始密碼子和終止密碼子，粗體斜體指示加尾信號，灰色陰影指示RRM識別基序

The initiation codon ATG and stop codon TAA are underlined. The polyadenylation signal AATTAAA are in bold and italic. The RNA recognition motif (RRM) are highlighted in grey shadow

2.2 Rcdnd的組織表達模式

采用半定量RT-PCR檢測了在150 dph軍曹魚各組織中的表達水平，結果表明，在性腺中特異表達，且卵巢和精巢中均檢測到較高的表達水平，在性腺外的其他組織中均無表達(圖4)。

2.3 Rcdnd在性腺周年發育過程中的表達模式

在精巢發育過程中，的表達水平呈逐漸上升趨勢，其在90 dph (Ⅱ期)的表達量最低，120 dph (Ⅱ～Ⅲ期)時表達量無顯著變化，而在150 dph (Ⅲ期)～ 360 dph (Ⅴ期)的表達量均出現顯著升高，其中，185 dph (Ⅲ期)時表達量上升至90 dph的2.68倍，210 dph (Ⅳ期)的表達量與185 dph (Ⅲ期)無顯著差異，而360 dph (Ⅴ期)時表達量進一步顯著升高并達到最大值，約為90 dph的3.33倍(圖5A)。

卵巢發育過程中，的表達水平先顯著升高后趨于平穩，90 dph (Ⅰ期)時的表達量最低，隨后在120 dph (Ⅰ～Ⅱ期)～360 dph (Ⅲ期)的表達量均顯著高于90 dph，其中，150 dph表達量上升至最大值，約為90 dph的2.25倍，185 dph (Ⅱ期)和210 dph (Ⅱ期)的表達量均較150 dph顯著降低，而185、210和360 dph發育時間點的相對表達量無顯著差異(圖5B)。

2.4 Rcdnd在性腺發育過程中的表達定位

利用切片原位雜交技術檢測mRNA在軍曹魚不同發育期性腺中的表達定位，結果顯示，120 dph軍曹魚的精巢中，mRNA的雜交信號主要分布于精原細胞、初級精母細胞和次級精母細胞的周緣，其中，在精原細胞和初級精母細胞中檢測到的雜交信號最強，次級精母細胞中的雜交信號明顯減弱，而精細胞中幾乎檢測不到雜交信號(圖6A1)。mRNA在210 dph和360 dph軍曹魚精巢中的表達定位模式與120 dph相似，雜交信號主要分布于精子形成過程中的精原細胞和精母細胞，在精細胞和成熟精子中的表達極其微弱(圖6B1、C1)。

圖2 軍曹魚dnd氨基酸序列的多重比對

方框表示5個氨基酸特異性保守結構域

The frame regions indicate the five amino acid specific conserved regions

圖3 基于dnd氨基酸序列構建的系統進化樹(NJ樹)

Bootstrap檢驗的重復次數為1000次，標尺0.05為進化距離

The tree is based on a 1000 bootstrap procedure, the scale bar 0.05 in terms of genetic distance is indicated below the tree

圖4 RT-PCR分析Rcdnd在軍曹魚不同組織中的表達

圖5 軍曹魚性腺周年發育過程中Rcdnd mRNA的表達水平

上標不同字母表示差異顯著(<0.05)

Different superscripts indicate significant difference (<0.05)

在卵巢發育過程中，mRNA主要在生殖細胞中表達，雜交信號均勻分布于細胞質及核仁內。mRNA在卵原細胞中的表達最強，而在初級卵母細胞中的表達相對較弱，且隨著卵母細胞的生長發育，在第Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ時相卵母細胞中檢測到的雜交信號強度無明顯變化(圖6A1、B1和C1)。

3 討論

圖6 原位雜交法分析不同發育期性腺中Rcdnd mRNA的定位

A1、B1和C1：120 dph、210 dph和360 dph精巢切片；A2、B2和C2：120 dph、210 dph和360 dph卵巢切片SG：精原細胞；PSC：初級精母細胞；SSC：次級精母細胞；ST：精細胞；SP：精子；OG：卵原細胞；Ⅰ：第Ⅰ時相卵母細胞；Ⅱ：第Ⅱ時相卵母細胞；Ⅲ：第Ⅲ時相卵母細胞

A1, B1 and C1: Sections of testis at 120 dph, 210 dph and 360 dph; A2, B2 and C2: Sections of ovary at 120 dph, 210 dph and 360 dph SG: Spermatogonia; PSC: Primary spermatocyte; SSC: Secondary spermatocyte; ST: Spermatid; SP: Spermatozoa; OG: Oogonium; Ⅰ: Oocyte at Stage Ⅰ; Ⅱ: Oocyte at Stage Ⅱ; Ⅲ: Oocyte at Stage Ⅱ

本研究采集的軍曹魚精巢樣品包含了性腺發育分期的Ⅱ～Ⅴ期，其中，90 dph時，精巢處于精母細胞增長期(Ⅱ期)；120 dph時，精巢處于Ⅱ～Ⅲ期；150 dph和185 dph時，精巢均處于精母細胞成熟期(Ⅲ期)，而210和360 dph精巢分別處于精子細胞變態期(Ⅳ期)和精子成熟期(Ⅴ期)。這些樣品中，的表達量隨著精巢的發育呈逐漸上升趨勢，在精子成熟期達到最大值，表明在軍曹魚精子發生過程中發揮一定的調控作用，這與大菱鲆(Lin, 2013)和藍鰭金槍魚(Yazawa, 2013)的研究結果相似。采集的卵巢樣品包含3個發育分期，其中，90 dph卵巢屬于卵原細胞增殖期(Ⅰ期)，120 dph卵巢處于Ⅰ～Ⅱ期，150、185和210 dph卵巢均屬于卵母細胞小生長期(Ⅱ期)，360 dph卵巢發育至初級卵母細胞大生長期(Ⅲ期)。表達量在卵原細胞增殖期最低，隨著卵巢的發育，表達量顯著升高并趨于穩定，卵巢由Ⅰ期發育至Ⅲ期的過程中，卵母細胞通過積累糖類、蛋白質、核酸等原生質，細胞體積不斷增大(Nishimura, 2014)，因此，在卵巢發育過程中較高的表達水平可能與生殖細胞原生質的積累密切相關。此外，大菱鲆卵巢發育過程中，基因的表達量在由Ⅰ期發育至Ⅱ期時出現顯著的升高，但隨著卵巢進一步發育至Ⅲ、Ⅳ期，其表達量呈下降趨勢(Lin, 2013)，這與基因在軍曹魚卵巢發育過程中的表達模式存在一定差異，由此推測，基因在卵巢發育過程中的表達模式存在物種差異性。

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Cloning and Expression Analysis ofDuring Annual Gonadal Development of Cobia ()

KUANG Jiehua1, MA Qian1,2①, CHEN Gang1,2①, MAO Feifan1, ZHOU Qiling1, HUANG Jiansheng1,2, SHI Gang1, ZHANG Jiandong1,2

(1. College of Fisheries, Guangdong Ocean University, Zhanjiang, Guangdong 524025, China; 2. Southern Marine Science and Engineering Guangdong Laboratory (Zhanjiang), Zhanjiang, Guangdong 524025, China)

In this study, the full length cDNA sequence of() was cloned using RACE technology for the first time. In total, the sequence comprises 1339 bp, including a 5′-UTR of 59 bp, a 3′-UTR of 173 bp, and an open reading frame of 1107 bp, encoding a protein of 368 amino acids. The deduced amino acid sequence contains a conserved RNA recognition motif and four conserved regions (CR1～4). Comparisons of the deduced amino acid sequence with those of other teleosts revealed the highest percentage identity (72.3%) with.Phylogenetic tree analysis also showed that the dnd ofwas most closely related to the homologous proteins ofReverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) resultsindicated thatwas specifically expressed in the gonads, but not in other tissues. The results of real-time quantitative PCR (qRT-PCR) revealed thatexpression tended to gradually increase as the testis developed (Stages Ⅱ to Ⅴ). During the development of the ovary (Stage Ⅰ to Ⅲ),expressionfirst increased substantially and then stabilized; the highest expression level was found at 150 days post hatching (dph) (Stage Ⅱ). Furthermore, the results of chemical in situ hybridization revealed thatmRNA was mainly expressed in germ cells but barely detected in somatic cells. In the testis,mRNA signals were concentrated in the periphery of spermatogonia and primary spermatocytes; they were only weakly detected in secondary spermatocytes and barely detected in spermatids and spermatozoa. In the ovary,mRNA was highly expressed in oogonia, and the signals became weak in primary oocytes dispersed in the perinuclear cytoplasm. There were no significant differences inmRNA signals detected in oocytes in phases Ⅰ, Ⅱ, and Ⅲ. In conclusion, these findings suggest that thegene may play an important role in gonadal development and provide a theoretical reference for revealing the regulatory mechanism of germ cell differentiation during gametogenesis in.

;; Gene cloning; Gonadal development; Expression analysis

MA Qian, E-mail: maq@gdou.edu.cn; CHEN Gang, E-mail: cheng@gdou.edu.cn

Q785; S917

A

2095-9869(2022)02-0119-10

10.19663/j.issn2095-9869.20210107002

* 財政部和農業農村部: 國家現代農業產業技術體系專項資金、南方海洋科學與工程廣東省實驗室(湛江)(ZJW-2019-06)和廣東海洋大學科研啟動經費資助項目(R19022)共同資助 [This work was funded by China Agriculture Research System of MOF and MARA, Fund of Southern Marine Science and Engineering Guangdong Laboratory (Zhanjiang) (ZJW-2019-06), and Program for Scientific Research Start-up Funds of Guangdong Ocean University (R19022)]. 鄺杰華，E-mail: 3242864479@qq.com

馬 騫，副研究員，E-mail: maq@gdou.edu.cn；陳 剛，教授，E-mail: cheng@gdou.edu.cn

2021-01-07,

2021-02-05

鄺杰華, 馬騫, 陳剛, 毛非凡, 周啟苓, 黃建盛, 施鋼, 張健東. 軍曹魚基因cDNA克隆及其在性腺周年發育過程中的表達. 漁業科學進展, 2022, 43(2): 119–128

KUANG J H, MA Q, CHEN G, MAO F F, ZHOU Q L, HUANG J S, SHI G, ZHANG J D. Cloning and expression analysis ofduring annual gonadal development of cobia (). Progress in Fishery Sciences, 2022, 43(2): 119–128

(編輯 馮小花)