多菌聯合發酵對辣木發酵品質和活性物質的影響

鄂曉迪 ， 李家明 ， 張玉鵬 ， 汪騰蛟 ， 左舒月 ， 李夢梅 ， 沙國新

（1.廣西大學動物科學技術學院，廣西南寧 530004；2.廣西習緣辣木有限公司，廣西南寧 530000）

辣木（Moringa oleifera Lam.）為多年生熱帶落葉喬木，屬辣木科（Moringa）辣木屬（Moringa），亦被稱為鼓槌樹、奇跡樹（馬波等，2017），在我國南方地區大規模種植。辣木年產量高，辣木葉粗蛋白質含量高且纖維含量低（許敏等，2016），目前已作為蛋白質飼料應用于養殖業。辣木的花、葉、籽、豆莢、根和莖均具有良好的營養價值和生理功效，如抗病毒、抗菌、消炎和抗潰瘍等作用（Falowo 等，2018），其用于畜禽養殖，有助于改善動物腸道健康、機體代謝能力和胴體品質。宋曉牧（2012）研究發現， 黑麥草和紫花苜蓿以65:35 的比例進行青貯，發酵品質和青貯效果最為理想，可作為較佳的混貯配比模式。 辣木稈和辣木莖葉的營養價值與黑麥草和紫花苜蓿的營養價值接近， 因此將辣木莖葉粉與辣木稈粉按2：1 的比例混合可以提高辣木的利用價值和青貯品質。

辣木中雖含豐富的營養物質， 但同時也含有一些抗營養因子如單寧、 植酸和皂苷等（Oloke等，2020）， 其會降低畜禽對飼料的利用效果。 目前，針對提高飼用辣木的利用率有很多措施，最為常見的是將辣木青貯發酵， 可以提高其營養價值和活性成分， 降低抗營養因子含量。 王田田等（2020）發現，多菌青貯比單一菌種青貯效果更為理想。因為黑曲霉在發酵過程中能產生纖維素酶、木聚糖酶、果膠酶、木質素降解酶等多種酶（朱玉霞等，2019），可以高效降解抗營養因子。釀酒酵母可以產生多種酶類， 與黑曲霉有很好的協同作用（王楠等，2015）。乳酸菌可提高發酵過程中乳酸的含量，降低pH 和氨態氮含量，可以提高發酵品質和有氧穩定性（Mugabe 等，2019）。 所以本試驗選取黑曲霉、 釀酒酵母和乳酸菌作為菌種進行發酵，以辣木稈粉和莖葉粉作為基質，探討多菌聯合發酵對辣木的活性成分和抗營養因子的影響，以期為新型辣木飼料的生產提供新的思路和理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 辣木莖葉粉、辣木莖稈粉由廣西習緣辣木有限公司提供。 黑曲霉（FCCC 114002）購自山東和眾康源生物科技有限公司， 釀酒酵母（GGSF16）來自本實驗室保藏菌株，乳酸菌購自廣東順德尚川生物科技有限公司。 辣木葉粉與辣木莖稈粉按照2:1 混合，其營養成分、活性物質和抗營養因子含量見表1。

表1 青貯原料營養成分（風干基礎）

1.2 主要試劑和儀器 濃硫酸、硫酸銅、丙酮、十二烷基硫酸鈉、 十六烷三甲基溴化銨等均購自北京索萊寶科技有限公司。 電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；K9860 全自動凱氏定氮儀， 濟南海能；A200i 半自動纖維分析儀， 美國ANKOM Technology；恒溫水浴鍋（HH-2），常州普天儀器制造有限公司； 紫外分光光度計 （SP-756）， 上海光譜儀器有限公司；Centrifuge 5804R離心機， 德國艾本德股份公司；N-1100S-WD 真空旋轉蒸發儀；干燥箱。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌種活化 黑曲霉和釀酒酵母分別接種于PDA 固體培養基中，28 ℃恒溫培養3 d，將乳酸菌接種于MRS 液體培養基中培養12 h。

1.3.2 種子液制備 將黑曲霉和釀酒酵母用接種環重復接種PDA 固體培養基中，培養至菌絲鋪滿整個培養基，用無菌純化水沖洗孢子；4 層擦鏡紙過濾之后用血細胞計數板計數， 用無菌純化水將其濃度調制后用血細胞計1×107cfu/mL。 乳酸菌培養 12 h 后，8000 r/min 離心 10 min， 調整細菌懸液菌落數約為1×107cfu/mL。

1.3.3 發酵過程與樣品收集 將辣木莖葉粉和辣木稈粉混勻后，接種活化后的黑曲霉、釀酒酵母和乳酸菌，菌種混合比例為1:1:1，濃度為1×107cfu/mL，添加量為0.1%。有氧階段發酵于塑料瓶中，用雙層紗布覆蓋瓶口，放于無菌培養箱中，溫度25 ℃、濕度 75%，每 6 h 搖晃一次，于 24、48、60、72 h 取樣檢測。 有氧發酵結束后將其轉入真空袋中，抽至真空放于室內 28 ～ 30 ℃發酵 3、5、7、9 d，取樣檢測。每個時間點打開4個樣品檢測各項指標。

1.4 發酵樣品的測定

1.4.1 營養成分測定 取適量各組發酵樣品，65 ℃ 烘干至恒重，粉碎后過40 目金屬篩，密封保存備用。 采用索氏提取法測定粗脂肪（EE）的含量，采用凱氏定氮法測定粗蛋白質（CP）含量，采用濾袋法測定粗纖維（CF）、中性洗滌纖維（NDF）和酸性洗滌纖維（ADF）含量。

1.4.2 活性成分及抗營養因子測定 黃酮含量測定參照陳慶鑰等（2020）方法，多糖含量測定參考楊玲等（2019）的方法進行，多酚的測定參照沈慧等（2016）的方法進行，植酸含量的測定參照李振剛（2012）的方法，參照 Makkar（2003）的方法測定水解單寧的含量。

1.4.3 發酵品質測定 取各組發酵樣品10 g，加入90 mL 無菌林格氏液，攪拌均勻，靜置30 min 后，用兩層紗布過濾， 濾液用pH 計測定其pH， 用苯酚-次氯酸鈉法測定氨態氮含量（馬莉等，2020）。

1.5 數據分析 采用 Microsoft Excel 軟件對數據進行整理， 采用 SPSS 24.0 進行差異顯著性分析，試驗結果以“平均值±標準差”表示，P ＜0.05表示為差異顯著，P ＜0.01 表示為差異極顯著。

2 結果分析

2.1 多菌聯合發酵對辣木莖葉發酵品質的影響 由表2 可知，有氧發酵階段，pH 隨著時間推移，呈現先降低后升高的趨勢， 各時間段表現為差異極顯著（P ＜0.01）。氨態氮含量在48 h 降到最低值，48 ～60 h 升到最高值，在 72 h 又逐漸降低，各組間無顯著差異。 在厭氧發酵階段，各時間段的pH和氨態氮含量無顯著差異。

表2 多菌聯合發酵對pH 和氨態氮的影響

2.2 多菌聯合發酵對辣木莖葉常規營養成分的影響 由表3 可知，有氧發酵階段，隨著時間的增加，CP 的含量逐漸升高，48 ～ 72 h 的 CP 含量較24 h 顯著升高 （P ＜ 0.05）。 72 h 的 ADF 含量與24 h 相比顯著上升（P ＜ 0.05），其中 48 ～ 60 h 與24 h 差異不顯著（P ＞ 0.05）。 而隨著時間的增加EE、NDF 和干物質損失無顯著變化（P ＞ 0.05）。 厭氧階段，CP 含量各時間段差異極顯著（P ＜ 0.01），在第 3 ～ 7 天，CP 含量急速上升， 直至第 7 天達到峰值20.34%，在第9 天時又呈現下降趨勢。干物質損失量隨著發酵時間的延長逐漸增多，發酵第5 ～9 天的干物質損失較第3 天顯著上升 （P ＜0.05），而 5 ～ 9 d 差異不顯著 （P ＞ 0.05）。 各時間段 EE、NDF 和 ADF 含量無顯著變化（P ＞ 0.05）。

表3 多菌聯合發酵各時間段常規營養成分的變化 %

2.3 多菌聯合發酵對辣木莖葉活性成分和抗營養因子的影響 由表4 可知， 在有氧階段，48 h 和60 h 黃酮含量有所提升， 但與24 h 的黃酮含量差異不顯著（P ＞0.05），在 72 h 黃酮含量達到最高值11.20 g/kg，與 24 h 呈差異顯著水平（P ＜ 0.05）。單寧的含量隨著時間推移，含量逐漸降低。 在48 h 時單寧含量有所降低，但與24 h 差異不顯著（P ＞0.05），在60 ～72 h 單寧含量趨于穩定， 與24 h 相比顯著降低（P ＜ 0.05）。 植酸含量持續升高，48 ～ 72 h 的植酸含量差異不顯著（P ＞0.05），但與 24 h 相比呈現差異顯著水平（P ＜0.05）。 多糖和多酚的含量在各時間段無顯著差異。 在厭氧發酵階段，單寧的含量在第7 ～9 天呈現上升趨勢，與3 ～7 d 差異顯著（P ＜ 0.05）。 黃酮、多糖、多酚和植酸的含量在各時間段無顯著差異性（P ＞ 0.05）。

表4 多菌聯合發酵各時間段活性成分及抗營養因子的變化 g/kg

3 討論

3.1 多菌聯合發酵過程中辣木莖葉發酵品質的變化 pH 和氨態氮是評價發酵品質的重要指標。 本試驗有氧發酵 24 ～ 48 h，pH 迅速下降，在48 ～ 72 h，pH 逐漸升高。 pH 迅速下降可能是在發酵過程中可溶性碳水化合物（WSC）為乳酸提供了營養物質，大量產酸，從而導致pH 下降（張文潔等，2016）。 隨著發酵時間的延長，乳酸含量逐漸下降，從而引起pH 升高。 在厭氧階段加入乳酸菌，使飼料的pH 下降。 而發酵飼料中產生的氨氮，易溶于水，與水發生反應形成氨水呈堿性，使pH 有所上升中和了乳酸降低pH 的作用。這可能是厭氧階段pH 相對穩定的原因。

氨態氮與總氮的比值可反映青貯飼料中蛋白質和氨基酸的分解程度， 氨態氮含量越低說明蛋白質分解越少青貯品質越好。由于乳酸菌的添加，pH 降低從而抑制有害菌的繁殖，保護營養物質不被分解和破壞，如 CP 等（胡向東等，2014）。 因此隨著乳酸菌的添加， 飼料發酵過程中的氨態氮含量有下降的趨勢。

3.2 多菌聯合發酵過程中辣木莖葉常規營養成分的變化 CP、CF、EE 等是表示飼料的重要常規營養指標。 發酵飼料中的粗蛋白質不僅包括飼料中原有的粗蛋白質， 也包含有微生物在發酵過程中轉化為菌體蛋白或者分泌蛋白。CP 在黑曲霉和釀酒酵母菌的協同發酵下粗蛋白質含量有所提高，在24 ～72 h 上升較為明顯，在厭氧條件下，乳酸菌的加入提高了飼料蛋白質的含量， 并在第7 天達到最高值。 可能是由于發酵過程中，微生物通過利用發酵基質將其轉化為細菌蛋白或分泌蛋白（張思宇2017），從而提高了發酵處理后底物的粗蛋白質含量。 同時，發酵過程中消耗了一定量的碳水化合物等物質，釋放出能量和二氧化碳，導致發酵產物總量減少以及底物中蛋白質含量的增加。

辣木除了含有較高CP 之外也含有纖維素、木質素、果膠等難以被動物消化吸收的物質，其會阻礙動物對營養物質的消化利用。 而釀酒酵母菌可以產生21 余種酶類（王楠等，2015），其中內切葡聚糖酶、 木聚糖酶和果膠酶等可以有效降解這些抗營養因子（朱玉霞等，2019），這與黑曲霉有很好的協同作用。 但在本試驗中，NDF 和ADF 在有氧階段均有不同程度的升高， 可能是發酵過程中碳水化合物和干物質相對損失而引起的。

3.3 多菌聯合發酵過程中辣木莖葉活性成分和抗營養因子的變化 辣木葉中富含黃酮和多糖等活性成分， 辣木中的黃酮具有清除人體內自由基、抗氧化、降低血糖血脂的藥理作用。 辣木中黃酮的含量較高，有研究發現辣木可提取的總黃酮平均含量為4.27%（張善添等，2017）。 辣木多糖是辣木有效活性成分之一。有研究表明，辣木多糖有抗癌、抗氧化、抗病毒、抗炎、降糖等功效（梁鵬等，2013）。除了含有黃酮和多糖這些活性成分以外，辣木也含有一些抗營養因子。然而影響辣木活性成分和抗營養因子的因素也有很多，如空氣、溫度、pH 等。

本研究中，辣木黃酮的含量，有氧階段在黑曲霉和釀酒酵母菌的作用下，黃酮含量逐漸上升，在72 h 時達到峰值，厭氧階段加了乳酸菌，雖然黃酮含量有所增加，但變化并不明顯。 多糖的含量在厭氧階段和有氧階段差異均不顯著， 但厭氧階段在乳酸菌的作用下含量明顯比有氧階段高。 黃酮含量提高可能是黑曲霉和釀酒酵母菌聯合發酵，能夠產生纖維素酶、果膠酶和木聚糖酶等多種酶類，破壞植物細胞壁， 將黃酮類活性物質從纖維素和蛋白質等聚合物中釋放出來， 有利于辣木黃酮的釋放（郭志鵬等，2020），而乳酸菌的添加有助于促進多糖的釋放。 有氧階段在黑曲霉和酵母菌的作用下單寧含量持續降低， 厭氧階段在第7 天時達到最低值，但在第9 天又呈上升趨勢。 因為黑曲霉和釀酒酵母菌能產生降解單寧的酶類（李鳳玲等，2018；孫宏等，2018），這可能是單寧降低的原因。而在第9 天單寧含量上升的原因，可能與pH 在第9 天上升有關。植酸的含量在整個發酵過程中呈現上升趨勢，影響植酸的因素有很多，可能是由于在此發酵環境條件下，植酸酶的活性受到了限制。

4 結論

本研究發現， 在有氧階段黑曲霉和酵母菌協同發酵有利于活性物質黃酮的釋放和營養物質粗蛋白質含量的提升，以及抗營養因子單寧的降解。在厭氧發酵階段， 乳酸菌有利于粗蛋白質和發酵品質的提升。 綜合試驗結果， 可以看出有氧發酵48 h 和厭氧發酵7 d 時發酵品質最佳， 可以得到高活性成分、高蛋白和低抗營養因子的發酵飼料。