牛黃及代用品的紅外指紋圖譜鑒別研究△

胡曉茹，倪景華，孫磊，傅欣彤，黨曉蕾，戴忠*，馬雙成*

1.中國食品藥品檢定研究院，北京 100050；2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥物研究所，北京 100050；3.北京市藥品檢驗(yàn)所，北京 102206

牛黃始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，是牛科動物牛Bostaurus domesticusGmelin的干燥膽結(jié)石，是一種常用的名貴中藥，其功效顯著，被廣泛應(yīng)用于650多種中成藥制劑中[1]。牛黃來源稀缺，為解決用藥問題出現(xiàn)了人工牛黃、體外培育牛黃和培植牛黃3 種代用品。其中人工牛黃即參照天然牛黃的已知成分，以牛膽粉、膽酸、豬去氧膽酸、牛磺酸和膽紅素等配制而成。體外培育牛黃是以牛的新鮮膽汁作母液，加入去氧膽酸、膽酸和復(fù)核膽紅素等制成。培植牛黃是在牛的活體膽囊中培植的干燥膽結(jié)石。目前培植牛黃已無企業(yè)生產(chǎn)。由于3 種代用品與牛黃之間價(jià)格差距較大，且成分相近，不易區(qū)分，故出現(xiàn)了混用、摻偽等問題，嚴(yán)重影響了牛黃藥材市場穩(wěn)定，所以有必要開展相應(yīng)的研究工作，建立牛黃及其代用品的鑒別方法。

中藥指紋圖譜技術(shù)可以從整體上反映產(chǎn)品的質(zhì)量，是目前中藥質(zhì)量控制的有效手段之一。目前中藥指紋圖譜研究主要借助于液相色譜、薄層色譜等色譜技術(shù)，具有反映信息豐富、結(jié)果易判斷的特點(diǎn)。但是由于分析結(jié)果受到色譜分析條件和提取方法的制約，并不能反映樣品的全部信息。紅外光譜法能夠?qū)衔锓肿又械幕瘜W(xué)鍵或者官能團(tuán)進(jìn)行表征，其在中藥材研究中所獲得的信息是研究樣本中所有組成成分的化學(xué)鍵或者官能團(tuán)的累加信息[2]。由于紅外光譜法無需采用提取等前處理，所以其表征的信息更全面且檢測快速。近年來，科研人員充分發(fā)揮了紅外光譜法分析速度快、檢測成本低、樣品量少的優(yōu)勢，采用紅外光譜法、二維相關(guān)紅外光譜法對肉蓯蓉、赤芍等中藥品種進(jìn)行了指紋圖譜研究，結(jié)果表明，紅外指紋圖譜結(jié)合數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)方法可以進(jìn)行產(chǎn)地區(qū)分、真?zhèn)舞b別等中藥質(zhì)量控制的研究[3?6]。本研究通過分析牛黃、體外培育牛黃、人工牛黃的紅外光譜指紋圖譜，結(jié)合數(shù)學(xué)多元統(tǒng)計(jì)的方法對數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析，從而達(dá)到對牛黃、人工牛黃和體外培育牛黃的鑒別。

1 材料

1.1 試藥

牛黃對照藥材（編號：cb12，批號：121328?201302）購于中國食品藥品檢定研究院；牛黃及人工牛黃樣品均為市售樣品，牛黃14 批，編號分別為cb13～cb24、cb32、cb38，經(jīng)中國食品藥品檢定研究院中藥民族藥檢定所康帥副研究員鑒定為牛科動物牛Bostaurus domesticusGmelin 的干燥膽結(jié)石；人工牛黃11 批，編號分別為cb25～cb29、cb31、cb33～cb37；體外培育牛黃12 批，11 批購自武漢健民大鵬藥業(yè)有限公司，編號分別為cb1～cb11，批號分別為121202、120401、120901、121101、130102、120601、120501、120702、121001、120801、120201，1 批為市售樣品，編號為cb30；溴化鉀（KBr）為光譜純，購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器

Nicolet 5700 型傅里葉變換紅外光譜儀（美國Thermo Electron Corporation公司），分辨率為4 cm-1，掃描范圍為4000～400 cm-1；XP2U 型百萬分之一電子天平（瑞士Mettler?Toledo 公司）；YP?2 型壓片機(jī)（上海山岳科學(xué)儀器公司）。

2 方法

2.1 樣品處理及紅外光譜測定

采用壓片法，分別取牛黃、體外培育牛黃或人工牛黃約1 mg，加入KBr 約240 mg，放入研缽中充分研細(xì)。壓片后置于紅外光譜儀中測試，以KBr 為背景累積掃描64 次，每個(gè)樣品平行測3 次，獲得3 個(gè)光譜圖，經(jīng)OMNIC 7.3軟件進(jìn)行多點(diǎn)基線校正，除去基線影響。將數(shù)據(jù)另存為.CSV 格式導(dǎo)入軟件ChemPattern（2017專業(yè)版）中進(jìn)行相似度運(yùn)算。

2.2 精密度試驗(yàn)

取同一份牛黃樣品（cb18），按2.1 項(xiàng)下方法制備樣品，連續(xù)進(jìn)行5 次紅外光譜采集，對采集的譜圖進(jìn)行分析。

2.3 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一份牛黃樣品（cb18），按2.1 項(xiàng)下方法平行制備5 份樣品壓片，進(jìn)行紅外光譜采集，分別測定1次，對采集的譜圖進(jìn)行分析。

2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一份牛黃樣品（cb18），按2.1 項(xiàng)下方法制備樣品，每隔15 min 進(jìn)行1 次光譜采集，連續(xù)測定5 次，對采集的譜圖進(jìn)行分析。

2.5 樣品測定

對所收集的牛黃及代用品，按2.1 項(xiàng)下方法制備樣品，進(jìn)行紅外光譜采集，對采集的譜圖進(jìn)行分析。

2.6 聚類分析

將數(shù)據(jù)另存為.CSV 格式導(dǎo)入ChemPattern 軟件，采用近鄰聚類法，利用平方歐式距離作為樣品的測度，進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析。

2.7 主成分分析（PCA）

應(yīng)用ChemPattern 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)度化處理，進(jìn)行PCA。

3 結(jié)果與討論

3.1 精密度試驗(yàn)

連續(xù)進(jìn)行5 次檢測所得紅外譜圖基本一致，相似度均值為0.99，表明儀器精密度良好。

3.2 重復(fù)性試驗(yàn)

5 份樣品所得紅外光譜圖基本一致，相似度均值為0.99，表明樣品重復(fù)性良好。

3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

同一份牛黃樣品連續(xù)測定5 次，所得紅外光譜圖基本一致，相似度均值為0.99，表明樣品在1 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.4 樣品測定

對所收集的牛黃及代用品進(jìn)行紅外光譜測定，結(jié)果見圖1～3。紅外光譜中1690～1600 cm-1是膽紅素鹽類及膽色素高聚物結(jié)構(gòu)中酰胺基團(tuán)的吸收信號，包括C=O 的伸縮振動和N?H 的彎曲振動。1500～1400 cm-1可能是膽紅素鹽類中吡咯環(huán)骨架振動吸收信號和NH2（N?H）的彎曲振動信號。1200、1050 cm-1為磺酸根的吸收信號[7?8]。通過直觀觀察可發(fā)現(xiàn)，在1700～1500、1200～900、700～500 cm-1，人工牛黃與天然牛黃和體外培育牛黃有明顯差異，可用于區(qū)別人工牛黃與天然牛黃和體外培育牛黃。天然牛黃與體外培育牛黃在紅外光譜上的差異主要體現(xiàn)在1550、1450、1250 cm-1峰的強(qiáng)弱不同，可明顯看出天然牛黃中對應(yīng)的峰強(qiáng)度弱于體外培育牛黃，尤其是1550 cm-1可能主要體現(xiàn)的是NH2（N?H）的信號，這與前期研究發(fā)現(xiàn)體外培育牛黃中牛磺酸含量遠(yuǎn)高于牛黃的結(jié)果一致[9]。

圖1 牛黃的紅外光譜

3.5 牛黃、體外培育牛黃和人工牛黃紅外光譜聚類分析

圖2 人工牛黃的紅外光譜

圖3 體外培育牛黃的紅外光譜

應(yīng)用ChemPattern軟件對樣品的紅外光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行系統(tǒng)聚類，結(jié)果見圖4，牛黃、體外培育牛黃和人工牛黃分別聚為一類。其中樣品cb24 與體外培育牛黃聚為一類，通過對比樣品cb24 的紅外光譜可以發(fā)現(xiàn)，其在1550、1450、1250 cm-1峰的吸收強(qiáng)弱與其他體外培育牛黃樣品相似度較高，而與天然牛黃存在明顯差異，見圖5。而樣品cb24 的外觀性狀與天然牛黃相似，結(jié)合高效液相色譜指紋圖譜分析結(jié)果，判斷樣品cb24 可能是以體外培育牛黃冒充天然牛黃。

圖4 牛黃及代用品紅外光譜圖聚類分析

圖5 樣品cb24與cb2、cb12的紅外光譜圖對比

3.6 牛黃、體外培育牛黃和人工牛黃紅外光譜PCA

應(yīng)用ChemPattern 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)度化處理，進(jìn)行PCA。根據(jù)主成分PC1、PC2 和PC3 得分繪制三維散點(diǎn)圖（圖6），其中PC1、PC2 和PC3 之和為90.17%。由圖6 可以看出，不同種類牛黃處于相對獨(dú)立的空間，反映了不同種類牛黃之間化學(xué)組成存在差異。其中體外培育牛黃均為同一企業(yè)樣品，分布較為集中，而天然牛黃來源于國內(nèi)不同省份，差異較大。

圖6 牛黃及代用品紅外光譜PCA結(jié)果

4 結(jié)論

本研究分析了牛黃、體外培育牛黃和人工牛黃的紅外光譜指紋圖譜，結(jié)果表明，牛黃及代用品的紅外光譜信號存在差異，人工牛黃在1700～1500、1200～900、700～500 cm-1波數(shù)處的峰強(qiáng)弱與天然牛黃和體外培育牛黃存在明顯差異，可用于區(qū)分人工牛黃；天然牛黃與體外培育牛黃在1550、1450、1250 cm-1波數(shù)處的峰強(qiáng)弱不同，天然牛黃中對應(yīng)的峰強(qiáng)度明顯弱于體外培育牛黃。采用聚類分析和PCA 等多元統(tǒng)計(jì)方法對紅外光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，牛黃、體外培育牛黃和人工牛黃的紅外光譜數(shù)據(jù)均可分別聚為一類，表明紅外光譜可用于牛黃、體外培育牛黃和人工牛黃的鑒別研究，該方法為牛黃及其代用品的鑒別提供了新的方向。同時(shí)本研究發(fā)現(xiàn)，牛黃及代用品的紅外光譜中的吸收峰對化學(xué)成分組成的變化較為靈敏。結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道，可采用紅外光譜法對復(fù)方制劑中各主要藥味藥效組分進(jìn)行表征，達(dá)到中藥復(fù)方質(zhì)量控制的目的[10]。是否可在本研究基礎(chǔ)上應(yīng)用紅外光譜開展牛黃制劑的表征，尋找不同牛黃投料制劑的紅外光譜特征，進(jìn)而開展牛黃制劑中牛黃種類的鑒別，有待進(jìn)一步研究。