蘆薈大黃素?鋁螯合物的合成表征及抗氧化活性研究△

韓冬月，姚妮，王楚茵，方芳，關君

北京中醫藥大學 中藥學院，北京 102488

許多慢性疾病，如阿爾茨海默病、糖尿病、帕金森病等都與人體氧化應激密切相關[1?5]，自由基和活性氧（reactive oxygen species，ROS）的過量生成或抗氧化防御系統能力下降是引起人體氧化應激的主要因素[6?7]。天然抗氧化劑因其能夠清除人體代謝所產生的自由基或ROS，且具有一定的藥用價值而受到越來越多的關注。但是，由于單一成分的天然抗氧化劑大多活性較弱，而且當其處于高劑量或是缺少協同物時往往表現出助氧化活性甚至產生毒性[8]，因此人們開始重視抗氧化協同作用的研究[9]。根據“中藥有效化學成分的配位化學學說”，某些中藥活性成分可與金屬離子配位，或產生原本不具備的新活性，或產生協同作用，或降低不良反應，或解除過量的金屬離子導致的中毒狀態[10?11]。這種具有配位能力的中藥活性成分稱為“配體類中藥”。具有抗氧化活性的“配體類中藥”與金屬離子配位后可以影響其自身的抗氧化活性，如金雀異黃酮和山柰酚與Cu2+配位后抗氧化活性增強[12]；大黃素與Mg2+配位后抗氧化活性增強[13]；平貝母多糖與Fe3+配位后抗氧化活性增強[14]等，這為尋找具有協同作用的抗氧化劑提供了重要的研究思路。

蘆薈大黃素（aloe?emodin，AE），化學名為1,8?二羥基?3?羥甲基蒽醌，屬蒽醌類成分，在中藥大黃、蘆薈、決明子中多有分布，具有抗氧化、抗腫瘤、抗衰老、抗炎、保護神經、調節免疫等藥理作用[15?19]。在分子結構方面，由于AE 具有2 個酚羥基，因此具備對超氧陰離子自由基及羥自由基的強清除作用[20]。AE 具有鄰近的1，8 位羥基和9 位羰基，以及完整的大π 鍵共軛體系，因此具備與金屬離子螯合配位的能力，可以作為“配體類中藥”使用?；谏鲜? 個結構特點，AE 可能成為一種具有抗氧化活性的“配體類中藥”。目前，AE 類配合物的研究大多關注于Fe3+、Fe2+、Cu2+、Mg2+等內源性金屬離子[21?22]，對外源性金屬離子Al3+卻少有報道。而Al3+是一種強神經毒素[23]，能夠促進氧化應激中ROS 和自由基的生成[24?25]，導致神經元的氧化損傷，與阿爾茨海默病、糖尿病等多種氧化應激性疾病的發生發展密切相關[26?30]。因此，基于“中藥有效化學成分的配位化學學說”，本研究假設AE 可通過與Al3+螯合配位，一方面降低Al3+的毒性以抑制自由基的產生，另一方面新形成的螯合物也很可能具有一定清除自由基的能力，從而發揮協同抗氧化作用，進而起到有效治療氧化應激性疾病的作用。

為驗證假設，本研究首次合成并表征蘆薈大黃素?鋁（AE?Al）螯合物，通過體外抗氧化實驗探討其對1,1?二苯基?2?三硝基苯肼（1,1?dipheny1?2?picryl?hydrazyl，DPPH）自由基、超氧陰離子自由基、羥自由基的清除能力，從而對其協同抗氧化作用進行評價，以期為“配體類中藥”治療氧化應激性疾病提供思路，為天然抗氧化劑的研究提供借鑒。

1 材料

DF?101S 型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鞏義市予華儀器有限責任公司）；YP10002 型電子天平（上海佑科儀器儀表有限公司）；FE20 型pH 計[梅特勒?托利多儀器（上海）有限公司]；DZF?6020 型真空干燥機（北京星德儀器設備有限公司）；Sorvall ST 8R 型高速冷凍離心機、Nicolet iS10 型紅外光譜儀（美國賽默飛公司）；TU?1901 型雙光束紫外?可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）；700M型核磁共振波譜儀（德國布魯克公司）。

AE（純度≥95%，上海源葉生物科技有限公司）；無水氯化鋁[九鼎化學（上海）科技有限公司]；溴化鉀（KBr，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；氘代二甲基亞砜（DMSO?D6，比利時Acros公司）；水楊酸[福晨（天津）化學試劑有限公司]；無水硫酸亞鐵（FeSO4）、鄰苯三酚、三羥甲基氨基甲烷（Tris）均購自羅恩試劑公司；氨水、無水甲醇、鹽酸（HCl）、乙醚、過氧化氫（H2O2）均購自天津市大茂化學試劑廠。

2 方法與結果

2.1 螯合物的合成

精密稱定AE 0.243 g（0.9 mmol）溶于適量無水甲醇中，40 ℃電磁加熱攪拌溶解，待大部分AE溶解，將用適量無水甲醇溶解的0.3 mmol AlCl3逐滴加入AE 的無水甲醇中，混合攪拌15 min 后用氨水甲醇溶液（1∶1）調節pH為7.35～7.45，此時溶液變渾濁，呈紅棕色，繼續40 ℃電磁加熱攪拌8 h后靜置24 h，得螯合物沉淀，將沉淀用無水甲醇離心洗滌5 次后再用乙醚離心洗滌5 次（3000 r·min-1離心5 min，離心半徑為7 cm），40 ℃真空干燥72 h，得紅棕色粉末狀固體。

2.2 螯合物的表征

2.2.1 紫外?可見分光光譜分析 用無水甲醇溶解AE 及AE?Al 螯合物至2×10-5mol·L-1，在波長200～600 nm進行掃描。AE及AE?Al螯合物紫外數據見表1、圖1，AE 在225、254、286、428 nm 處有強吸收帶。225 nm 處為苯環的共軛體系譜帶，254、286 nm 處為醌樣結構形成的吸收帶，428 nm 處為醌羰基吸收帶。AE?Al螯合物的紫外光譜圖與AE 相比，吸收峰的形狀沒有太大變化，但吸收峰在225 nm處發生1 nm的輕微紅移，在428 nm處發生2 nm的紅移，且吸收峰的強度增大。428 nm 處為AE 醌羰基形成的吸收帶，螯合物在此處發生紅移說明醌羰基參與了配位成鍵，且形成螯合物的同時沒有破壞蒽醌環的骨架[21]。峰位移動的原因可能為形成螯合物后，分子中電子的離域程度增大，致使電子躍遷時所需能量降低，吸收峰紅移。螯合物在237、514 nm 處出現新的紫外吸收帶，推測是由于鋁配位成鍵形成的吸收帶。

表1 AE及AE-Al螯合物的溶液吸光度

圖1 AE及AE-Al螯合物紫外-可見光譜圖

2.2.2 紅外光譜分析 采用固體KBr 壓片法，在400～4000 cm-1對AE 及AE?Al 螯合物進行紅外光譜掃描。AE 及AE?Al螯合物主要紅外特征峰有明顯差異，具體數據見表2、圖2。3300～3500 cm-1為羥基的特征伸縮振動峰，AE 及AE?Al螯合物在此區域均有寬而強的羥基伸縮振動峰，在1200～1300 cm-1區域內均有酚羥基的C?O 伸縮振動峰，由此可見，在螯合物中有酚羥基的存在。C=O 伸縮振動峰在AE中位于1 675.31、1 628.07 cm-1，當形成螯合物后，移至低波1 667.59、1 617.41 cm-1處，說明AE 中醌羰基的O 與金屬離子配位，從而引起羰基成鍵電子云密度偏離幾何中心，移向O 原子。分子中C?O 的振動頻率也向低波處移動，分析其可能為羰基發生螯合后引起相應的變化。Al 元素質量較大且配位鍵較弱，因此配位鍵的伸縮振動峰一般出現在低頻區，本實驗中，Al?O的伸縮振動峰出現在593.28 cm-1處。

圖2 AE及AE-Al螯合物紅外光譜圖

表2 蘆薈大黃素及其螯合物主要特征峰振動頻率 cm-1

2.2.3 核磁共振氫譜（1H?NMR）及核磁共振碳譜（13C?NMR）分析 為了進一步探討AE 與Al3+的配位情況，本實驗以DMSO?D6 為溶劑，在700 Hz 下測定AE 及AE?Al 螯合物的1H?NMR 譜圖，167 Hz 下測定AE及AE?Al螯合物的13C?NMR譜圖。

由AE 及AE?Al 螯合物的1H?NMR 數據（表3）可知，AE 的C?1、C?8 位酚羥基峰化學位移為δ11.89、11.83；而相比AE，AE?Al 螯合物失去1個酚羥基質子峰，僅在δ11.96 出現一弱峰，說明AE 的1 個酚羥基失去質子與Al3+形成螯合物。AE 的C?1、C?8位酚羥基所處空間結構相似，均可與C?9位羰基形成分子內氫鍵，而C?3 位羥甲基的給電子效應使得C?8位酚羥基更易解離，由此推測，AE的C?8位氧原子通過C?9位氧原子與Al3+形成螯合物。由于Al3+的吸電子效應，使得C?1 位?OH 的電子云密度降低，移向低場，化學位移升高。

表3 AE及AE-Al螯合物的1H-NMR信息（700 MHz，DMSO）

由AE 及AE?Al 螯合物的13C?NMR 數據（表4）可知，兩者13C?NMR 譜變化不大，僅化學位移發生微小增加，說明未有新環境的C生成。由于Al3+的吸電子效應，使得電子云密度降低，移向低場，使得化學位移升高；配位后形成的六元環結構，使螯合物的共軛體系增加，共軛效應增大，去屏蔽作用增強，移向低場，化學位移值增大。

表4 AE及AE-Al螯合物的13C-NMR信息（167 MHz，DMSO）

2.2.4 配位比的測定 采用等摩爾連續變化法（又稱Job 法）測定螯合物的配位比。保持AE 與Al3+的濃度之和為2.4×10-4mol·L-1，并連續改變AE 與Al3+濃度的比值，混合后于40 ℃水浴反應90 min后，在514 nm 處測定吸光度（A），以A為縱坐標（Y），AE 的摩爾分數（xR）為橫坐標（X）作圖（圖3）。根據兩邊線性部分的延線相交點所對應的xR，即可求出配位比例。線性回歸方程為Y=0.192 4X-0.002 8（r=0.997 2），Y=-0.421 7X+0.419 3（r=0.997 7），通過計算可得配位比為AE∶Al3+=2∶1。

圖3 Job法測定AE-Al螯合物配位比

2.2.5 螯合物的結構 根據紫外?可見分光光譜、紅外光譜、1H?NMR、13C?NMR、Job 法結果，推測AE 通過C?8 位羥基氧和C?9 位羰基氧與Al3+雙齒配位，配位比為2∶1，見圖4。

圖4 蘆薈大黃素-鋁螯合物可能的結構式

2.3 抗氧化活性

2.3.1 對DPPH 自由基的清除作用 取不同質量濃度的AE 及AE?Al 螯合物的無水甲醇（2.5、5.0、10.0、20.0、40.0 mg·L-1）各2 mL 于試管中，加入25 mg·L-1DPPH?無水甲醇溶液2 mL，室溫避光反應30 min，于516.5 nm 處測定A[31]，以無水甲醇代替DPPH?無水甲醇溶液，測定A，以蒸餾水代替樣品測定A。每個樣品平行測定3 次，按公式（1）計算DPPH自由基的清除率。

式中A1代表樣品吸光度，A2代表陰性對照吸光度，A0代表空白對照吸光度。

結果如圖5 所示，AE 及AE?Al 螯合物均具有清除DPPH 自由基的能力，且清除率隨濃度增加而增大，具有濃度依賴性。在實驗濃度范圍內，螯合物清除DPPH 自由基的能力強于同濃度AE 配體，但總體清除率不高，均低于30%。

圖5 AE及AE-Al螯合物對DPPH自由基的清除能力（,n=3）

2.3.2 對超氧陰離子自由基的清除作用 采用鄰苯三酚自氧化法進行測定。取Tris?HCl 溶液（50 mmol·L-1，pH=8.2）4.5 mL 于試管中，25 ℃水浴反應20 min，加入不同質量濃度的AE 及AE?Al螯合物的無水甲醇（2.5、5.0、10.0、20.0、40.0 mg·L-1）1 mL，加入25 ℃預熱的3 mmol·L-1鄰苯三酚溶液0.5 mL 于試管中，混合均勻，25 ℃水浴精確反應5 min，加入8 mol·L-1鹽酸溶液終止反應，于319.5 nm 處測定A[32]，以蒸餾水代替鄰苯三酚溶液，測定A，以蒸餾水代替樣品測定A。每個樣品平行測定3 次，按公式（1）計算超氧陰離子自由基的清除率。

結果如圖6 所示，AE 及AE?Al 螯合物均具有清除超氧陰離子自由基的能力，且清除率隨濃度增加而增大，具有濃度依賴性。在實驗濃度范圍內，螯合物清除超氧陰離子自由基的能力強于同濃度AE配體。

圖6 AE及AE-Al螯合物對超氧陰離子自由基的清除能力（,n=3）

2.3.3 對羥自由基的清除作用 采用水楊酸法進行測定。取不同質量濃度的AE 及AE?Al螯合物的無水甲醇（2.5、5.0、10.0、20.0、40.0 mg·L-1）1 mL，加入6 mmol·L-1FeSO4溶液、6 mmol·L-1水楊酸溶液、6 mmol·L-1H2O2溶液各1 mL，37 ℃水浴反應1 h，于510 nm 處測定A[33]，以蒸餾水代替H2O2溶液測定A，以蒸餾水代替樣品測定A。每個樣品平行測定3次，按公式（1）計算羥自由基的清除率。

結果如圖7 所示，AE 及AE?Al 螯合物均具有清除羥基自由基的能力，且清除率較高，清除率隨濃度變化不大。在實驗濃度范圍內，螯合物清除羥基自由基的能力強于AE配體。

圖7 AE及AE-Al螯合物對羥基自由基的清除能力（,n=3）

3 討論

本研究在甲醇體系下，以AE 為配體，Al3+為形成體，首次合成了AE?Al 螯合物，應用紫外?可見分光光譜、紅外光譜、1H?NMR、13C?NMR 及Job 法對其結構進行表征，并考察螯合物的抗氧化活性。結果表明，AE通過C?8位羥基氧和C?9位羰基氧與Al3+螯合配位，配位比為2∶1，且在本實驗條件下，螯合物清除DPPH 自由基、超氧陰離子自由基、羥自由基的能力均強于AE 配體，初步證實了AE 與Al3+產生了協同抗氧化作用。本研究結果一方面證實了AE?Al 螯合物的可存在性，且由于螯合物易代謝出體外從而認為可以降低Al3+的毒性以抑制自由基的產生，另一方面新形成的螯合物也具有一定清除自由基的能力，進而驗證了前文所提出的假設，為“配體類中藥”治療氧化應激性疾病提供了研究思路。

值得一提的是，研究組在阿爾茨海默病與金屬離子關系的研究中，發現體內異常代謝的Al3+等金屬離子與阿爾茨海默病多種發病機制密切相關，如Al3+可促進β?淀粉樣蛋白（β?amyloid protein，Aβ）的生成與聚集、Tau蛋白聚集與異常磷酸化、自由基損傷等。阿爾茨海默病屬中醫“癡呆”“絡病”范疇?！岸緭p腦絡”病機假說是現代中醫對癡呆病因病機的解釋，認為“內生毒邪”是臟腑功能和氣血運行失常使體內的生理或病理產物因不能及時排出，蘊積過多而生成[34]。因此，基于對中醫“毒損腦絡”理論及阿爾茨海默病病機的認識，研究組將過量的自由基、異常磷酸化的Tau 蛋白及Aβ，歸為“內生毒邪”范疇，而異常代謝的Al3+等金屬離子是誘導“內生毒邪”產生的“外邪”，進而提出了“配體類中藥”——大黃蒽醌類單體治療阿爾茨海默病的作用機制假說：一方面大黃蒽醌類單體通過配位“金屬離子外邪”以消除“內生毒邪”，另一方面大黃蒽醌單體與“金屬離子外邪”形成的配合物也可以除去自由基這種“內生毒邪”[35]。本研究結果證實了AE?Al 螯合物的可存在性及清除自由基的能力，在一定程度上驗證了此假說，為研發其他“配體類中藥”提供借鑒。