基于網絡藥理學的酸棗仁與酸棗果肉抗失眠作用機制比較△

李金晶，劉紅波，姚卓汝，唐志書*，錢大瑋，王梅，宋忠興

1.陜西中醫藥大學/陜西中藥資源產業化省部共建協同創新中心，陜西 咸陽 712083；2.秦藥特色資源研究與開發國家重點實驗室（培育）/陜西省創新藥物研究中心，陜西 咸陽 712083；3.陜西中醫藥大學 附屬醫院，陜西 咸陽 712000；4.南京中醫藥大學/江蘇省中藥資源產業化過程協同創新中心，江蘇 南京 210023

酸棗Ziziphus jujubaMill.var.spinosa（Bunge）Hu ex H.F.Chow 為鼠李科植物，目前臨床用藥部位是酸棗的干燥成熟種子，即酸棗仁，具有養心補肝、寧心安神、斂汗、生津等功效，常用于虛煩不眠、驚悸多夢、體虛多汗及津傷口渴等[1]。酸棗果肉為酸棗仁加工過程中的副產物，富含可溶性總糖，草酸、蘋果酸、檸檬酸等有機酸，鈣、磷、鐵、鎂等無機元素，7 種人體必需氨基酸，維生素B1、維生素B2、維生素C，β?胡蘿卜素等[2]，除少量酸棗果肉作食品應用外，常被當做廢棄物丟棄，造成了資源的浪費。

對于酸棗的藥用部位，歷代醫家存在諸多的異議，最初從漢代到南北朝文獻中一直記載的是“酸棗”而非“酸棗仁”[3]。有研究表明，生酸棗仁、炒酸棗仁及酸棗果肉均對氯苯丙氨酸失眠模型大鼠的學習記憶能力有改善作用，酸棗果肉的作用更優于酸棗仁，具有良好的鎮靜安眠作用[4?5]。

基于中藥成分多、作用靶點多和作用途徑復雜等特點，網絡藥理學通過解析中藥不同組分間的相互關系，研究疾病的生物通路信號，建立活性成分與靶點、疾病的整體作用關系，與中藥治療的整體觀相契合，與中醫理論的“同病異治”和“異病同治”相似[6?7]。故本研究借助網絡藥理學方法[8]及分子對接技術探索酸棗仁與酸棗果肉治療失眠的物質基礎及作用機制的異同，為進一步開發酸棗資源的價值提供依據。

1 資料與方法

1.1 酸棗仁與酸棗果肉活性成分篩選

以“Ziziphi Spinosae Semen”為檢索詞，通過中藥系統藥理學分析平臺（TCMSP，https://tcmspw.com/tcmsp.php）[9]、BATMAN?TCM 數據庫[10]（http://bionet.ncpsb.org/batman?tcm/）、中醫藥百科全書數據庫（ETCM）[11]收集酸棗仁的成分，通過文獻補充酸棗仁成分并收集酸棗果肉的成分，將收集到的成分以口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18 為標準進行活性成分篩選，除此之外，不符合標準但文獻中報道有明確藥理作用的成分也納入作為活性成分。

1.2 酸棗仁與酸棗果肉靶點篩選

通過TCMSP 收集活性成分相關靶點，TCMSP中沒有靶點及靶點較少的活性成分在PubChem 數據庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中下載其SMILES 號并導入Similarity Ensemble Approach 數據庫（SEA，http://sea.bkslab.org/）預測其可能作用的靶點，將收集到的靶點通過UniProt 數據庫（https：//www.uniprot.org）標準化。

1.3 疾病靶點篩選

以“insomnia”為關鍵詞通過GeneCards（https://www.genecards.org/）[12]、美國國家生物技術信息中心（NCBI）數據庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）[13]收集與失眠相關的靶點，將收集到的靶點通過UniProt數據庫標準化。

1.4 酸棗仁與酸棗果肉治療失眠的活性成分及靶點

分別將收集到的酸棗仁與酸棗果肉活性成分靶點與失眠靶點進行映射，得到其共同靶點及共同靶點對應的成分，即為酸棗仁及酸棗果肉治療失眠的活性靶點及成分。

1.5 功能富集分析

分別將酸棗仁與酸棗果肉治療失眠的靶點導入DAVID 6.8 數據庫（https://david.ncifcrf.gov/）[14]進行基因本體（GO）生物學過程富集分析和京都基因與基因組百科全書（KEGG）信號通路富集分析，對比酸棗仁與酸棗果肉治療失眠作用機制的異同。

1.6 中藥?成分?靶點?通路網絡構建

通過Cytoscape 3.8.0[15]軟件分別構建酸棗仁與酸棗果肉治療失眠的中藥?成分?靶點?通路網絡，利用Cytoscape 3.8.0 內置的Network Analyzer 工具對網絡進行拓撲學分析，并通過度（degree）值等參數預測出酸棗仁與酸棗果肉治療失眠的核心成分及核心靶點。

1.7 分子對接驗證

為了驗證預測的可靠性，通過PubChem 數據庫下載成分的結構，通過PDB 數據庫（https://www.rcsb.org/）下載排名靠前的核心靶點結構，將成分及靶點結構通過AutoDock軟件進行加氫、計算電荷處理后進行分子對接，結合能最低的結構為最優結構，通過Open Babel GUI 軟件將對接結果的.pdbqt格式轉化為.pdb 格式，最后使用PyMOL 軟件對圖像進行處理分析。

2 結果與分析

2.1 酸棗仁與酸棗果肉活性成分篩選

通過TCMSP、ETCM、BATMAN?TCM 及文獻篩選[16?19]得到酸棗仁活性成分17 個，酸棗果肉活性成分15 個，其中共同活性成分7 個。活性成分信息見表1。

表1 酸棗仁與酸棗果肉成分信息

2.2 酸棗仁與酸棗果肉靶點篩選

將酸棗仁與酸棗果肉篩選得到的活性成分導入TCMSP數據庫收集靶點，并通過Similarity Ensemble Approach數據庫對TCMSP中沒有靶點及靶點較少的活性成分進行補充，刪除重復值后得到酸棗仁靶點579個，酸棗果肉靶點410個，兩者共同靶點357個。

2.3 疾病靶點篩選

通過GeneCards、NCBI 數據庫收集到與失眠相關的靶點分別為2563、48 個，刪除重復值共得到2563個靶點。

2.4 酸棗仁與酸棗果肉治療失眠的活性成分及靶點

分別將酸棗仁與酸棗果肉的靶點與失眠的靶點進行映射，酸棗仁與失眠的共同靶點有151 個，酸棗果肉與失眠的共同靶點有116 個，其中三者的共同靶點有102 個，韋恩圖見圖1，共同靶點對應的成分即為酸棗仁與酸棗果肉治療失眠的活性成分。

圖1 酸棗仁與酸棗果肉活性成分-失眠癥疾病靶點韋恩圖

2.5 功能富集分析

分別將酸棗仁與酸棗果肉治療失眠的靶點導入DAVID 6.8 數據庫進行GO 功能富集分析和KEGG通路分析，酸棗仁共得到GO 條目527 個（P＜0.05），其中生物過程（BP）375 個、細胞組成（CC）45 個、分子功能（MF）107 個，共得到KEGG 通路106 個。酸棗果肉共得到GO 條目426 個（P＜0.05），其中BP 299 個、CC 40 個、MF 87 個，共得到KEGG 通路107個。富集結果見圖2～4。結果顯示，酸棗仁與酸棗果肉富集的BP 相同條目共244個，CC 相同條目共32 個，MF 相同條目共70 個，KEGG 相同通路共97 個。結果表明，酸棗果肉與酸棗仁治療失眠參與的生物過程等有很大的相似性，均可通過參與藥物反應、RNA 聚合酶Ⅱ啟動子轉錄的正調控、炎癥反應、多巴胺分解代謝過程等生物過程；作用于質膜、細胞表面、γ?氨基丁酸A 型（GABA?A）受體復合物、高爾基體等；具有與酶結合、核轉錄因子?κB（NF?κB）結合、GABA 門控氯離子通道活性、類固醇激素受體結合等分子功能。共同涉及的KEGG 通路有腫瘤壞死因子（TNF）信號通路、多巴胺能突觸、細胞凋亡、血清素能突觸、GABA能突觸、NF?κB信號通路等。

圖2 酸棗仁治療失眠靶點的GO富集（前10位）

2.6 中藥?成分?靶點?通路網絡構建

分別將酸棗仁與酸棗果肉治療失眠的成分、靶點、通路導入Cytoscape 3.8.0 軟件，構建中藥?成分?靶點?通路網絡，見圖5。酸棗仁與酸棗果肉治療失眠網絡交集見圖6。通過Cytoscape 3.8.0 軟件內置功能Network Analyzer對網絡進行拓撲分析，分別得到酸棗仁與酸棗果肉治療失眠的核心成分及核心靶點，結果見表2～3。

圖6 酸棗仁與酸棗果肉治療失眠的中藥-成分-靶點-通路共同部分網絡

2.7 分子對接結果

圖3 酸棗果肉治療失眠靶點的GO富集（前10位）

圖4 酸棗仁與酸棗果肉治療失眠KEGG通路富集（前10位）

將酸棗仁與酸棗果肉治療失眠排名靠前的核心成分及靶點進行分子對接，通過結合能評估配體和受體的結合能力，結合能＜0 表示配體與受體能夠自發結合，值越小表示結合活性越高。對接結果如表4 所示，分子與標靶蛋白的結合能均小于0，說明配體與受體均可以自發結合，其中槲皮素與磷脂酰肌醇3?激酶（PIK3CG）、磷脂酰肌醇?3激酶調節亞基1（PIK3R1）、蛋白激酶B1（Akt1）、V?HA?RAS 肉瘤病毒癌基因同源物（HRAS）、TNF、細胞周期素D1（CCND1）、白細胞介素?6（IL?6）、IL?1β有一定結合活性；熊果酸與V?Rel 網狀內皮增生病毒癌基因同源物A（RELA）、TNF、CCND1 的結合能均小于-5 kcal·mol-1（1 kcal≈4.186 kJ），表現為較強的結合活性。部分分子對接模式圖見圖7。分子對接結果顯示，核心靶點PIK3CG、PIK3R1、TNF、IL?6、IL?1β等與核心成分均有較好的結合能力。

圖7 酸棗仁與酸棗果肉治療失眠核心成分與靶點分子對接模式圖

表4 酸棗仁與酸棗果肉治療失眠核心成分與靶點分子對接結果 kcal·mol-1

3 討論

失眠表現為入睡和（或）睡眠維持困難所致的睡眠質量或數量達不到生理需求而影響白天社會功能的一種主觀體驗，是常見的睡眠障礙性疾病[20]。失眠癥的發生涉及社會環境、自身行為活動，以及器官、細胞、分子等多個層面，是多種因素共同作用的結果。隨著對失眠發生機制的深入研究，學者們發現失眠與自主神經系統、神經內分泌、神經免疫等多個層面的過度覺醒；相關腦區促覺醒系統過度激活和（或）睡眠系統受到抑制；神經遞質紊亂（GABA、5?羥色胺、食欲肽含量減少，乙酰膽堿、多巴胺、去甲腎上腺素增多）；神經?內分泌?免疫系統失調（下丘腦?垂體?腎上腺軸的激活，褪黑素分泌功能紊亂或下降，TNF?α、IL、干擾素等促炎細胞因子引起的免疫功能受損）等有關[21?24]。以往臨床對失眠的治療主要以化學藥為主，其雖可在短時間內達到良好的治療效果，但可能出現藥物成癮性，患者會出現依賴性，停藥后出現繼續失眠的情況[25]。中醫常用酸棗仁配伍其他中藥治療失眠，其記載最早可追溯到《神農本草經》，隨后酸棗仁在改善失眠的功效及使用方法于《本草綱目》中提出，其療效顯著并具有長期可用性，是治療失眠的理想藥材[26]。目前，酸棗仁及其配伍組方改善失眠的機制[27]、藥效成分[28]，以及酸棗仁對神經、精神類疾病的作用機制預測[29]等研究較多。本研究借助網絡藥理學方法從活性成分、靶點、生物功能及通路等方面對酸棗仁與酸棗果肉治療失眠的作用機制進行預測及對比分析，探索酸棗果肉的開發價值。結果發現，酸棗仁與酸棗果肉治療失眠的物質基礎及作用機制有很大的相似性，均可通過槲皮素、熊果酸、棕櫚酸、亞油酸、齊墩果酸等成分，作用于TNF、多巴胺能突觸、血清素能突觸、GABA 能突觸、NF?κB 等信號通路達到治療失眠的效果。

表3 酸棗仁與酸棗果肉治療失眠核心靶點

依據中藥?成分?靶點?通路網絡的拓撲分析，度值及中介中心性最高的成分均為槲皮素。Kambe等[30]研究了槲皮素對睡眠?覺醒的調節影響，發現正常大鼠腹腔注射槲皮素可以顯著降低快速眼動睡眠，而腦內注射GABA 受體拮抗劑阻斷了槲皮素引起的快速眼動睡眠減少，表明槲皮素通過激活GABA 受體來改變睡眠?覺醒。Kim等[31]采用ICR小鼠及SD大鼠進行了槲皮素相關糖苷的促睡眠作用研究，同樣發現槲皮素與GABA 受體具有潛在作用。GABA 是存在于中樞神經系統中的抑制性神經遞質，與睡眠相關的中樞結構中存在很多GABA 能神經元[32]，酸棗仁與酸棗果肉可通過調節失眠患者腦皮質GABA的水平和GABA 受體mRNA 的表達從而達到治療失眠的效果[33]。還有學者發現槲皮素可以通過調節5?羥色胺系統增強產生催眠作用[34]。5?羥色胺又名血清素，是研究最廣泛的神經遞質，廣泛存在于大腦皮層質和神經突觸內，酸棗仁與酸棗果肉可能通過作用于血清素突觸，促進慢波睡眠產生并縮短入眠期和淺睡期，起到催眠的作用[35]。李梅等[36]發現酸棗仁湯可以介導5?羥色胺與多巴胺等神經遞質水平升高，進而改善焦慮性失眠。熊果酸為酸棗果肉中度值及中介中心性較高的成分，劉曉巖等[37]發現正常大鼠在注射熊果酸后，大腦皮層、海馬和下丘腦3 個部位IL?1β及TNF?α水平顯著升高，從而可能通過提高一氧化氮的水平最終達到促進睡眠作用，表明熊果苷具有很好的鎮靜催眠作用。吳東南等[38]實驗發現睡眠剝奪模型大鼠海馬NF?κB p65 的mRNA和蛋白表達水平增高，同時血清中促炎因子TNF?α、IL?1β、IL?6 含量明顯增加，酸棗仁湯可以通過抑制NF?κB 通路減輕神經炎癥，改善睡眠及失眠介導的學習記憶障礙。除此之外，酸棗仁與酸棗果肉也可能通過多成分、多靶點、多通路之間相互作用從而達到治療失眠的效果。

目前臨床上酸棗仁有效成分的提取與分離工序繁瑣，且酸棗仁含油脂較多，儲存不便，市場價格也不斷提高，酸棗果肉的廢棄使酸棗資源不能得到充分利用，且對環境造成一定程度的污染。酸棗果肉中含有的酸棗多糖還具有抗衰老、增強免疫力、改善心血管等作用[39]，若能開發酸棗果肉的藥用價值將使酸棗的綜合利用水平得到進一步的提升。