馬駿池,趙晉彤,高世勇,賈紹華,張秀娟
哈爾濱商業大學 藥學院,黑龍江 哈爾濱 150076
五味子Schisandra chinensis(Turcz.)Baill 是一種常用的收斂固澀藥,具有益氣生津、寧心安神的功效,屬藥食同源藥材?!侗静菥V目》曾記載,將五味子分為北五味子與南五味子兩類。五味子含有的活性化學成分主要有木脂素、多糖、揮發油等。北五味子揮發油成分、總木脂素的含量及多糖療效均大于南五味子[1]。其中,五味子乙素(schisandrin B,Sch B)是北五味子中含量最高的聯苯環辛烯類木脂素,化學式為C23H28O6,結構見圖1,相對分子質量為400.46[2]。由于Sch B 在臨床上具有抗炎、抗氧化等多種藥理作用,采用何種提取工藝實現原藥材最大限度的利用成為現在研究的熱點。本文綜述了近年來Sch B 的提取工藝與檢測方法的研究現狀,為更有效地提高Sch B 的生物活性提供更多有價值的參考。

圖1 五味子乙素的結構
在傳統中藥的研究中,提取工藝是整個藥物研究中的重要環節,現代科學技術的不斷進步推動了Sch B提取工藝的發展進程,為后續的分離純化、檢測及藥材的質量評定提供條件,為相關新藥的開發奠定了基礎。目前,Sch B的提取工藝主要有熱回流提取、超聲提取、微波提取、生物提取、超臨界流體提取等,各提取方法的原理及優缺點見表1。

表1 五味子乙素提取工藝總結
熱回流提取法是最為常見的Sch B 傳統提取法,Sch B是木脂素的一種,利用相似相溶原理,采用回流加熱的方法,保證了乙醇體積分數不變,且同時具有設備簡單、操作方便的優點。李奉勤等[3]通過正交試驗優化出乙醇熱回流提取法的最佳提取條件為加5倍量的85%乙醇,調節pH為5.5,回流提取2 h。
Zhang 等[4]利用部分析因設計(FFD)和響應面法(RSM)優化了超聲輔助提取法,結果表明,在60 ℃的條件下,95%乙醇,液固比為5 mL·g-1,功率600 W 超聲70 min,所得Sch B 最大質量分數為5.80 mg·g-1。超聲輔助提取法也是藥物成分提取的一種常見手段,通過超聲波的空化效應和機械作用破碎藥材的細胞壁,使有效成分游離于溶劑,進而增大提取效率。
微波提取是通過微波輻射對被提取物進行適當破碎,增大接觸面積而提高提取效率的現代科技手段。張立輝等[5]對復方五仁醇制劑中五味子乙素的提取工藝進行比較,得出最佳條件為6 倍量85%乙醇,微波功率500 W,時間為8 min,所得Sch B 質量分數最高為0.355%。Cheng 等[6]通過使用超聲?微波輔助提取法(UMAE),RSM 優化UMAE 參數,發現微波功率430 W,乙醇體積分數84%,樣品粒度120目,溶媒?原料比15∶1,萃取時間2.1 min 時,可得到包括Sch B 等五味子中的5種木脂素的質量分數為(14.22±0.135)mg·g-1。
陰冠秀等[7]研究結果表明,酶解溫度52.89 ℃,提取時間4.04 h,酶用量0.96%,酶解法輔助超聲得到Sch B 最優產率為0.262%。生物提取具有較高專一性,提取較為充分。生物提取通??膳c其他提取方法,如超聲提取法等聯用,是現代藥物提取技術中一類較有發展前景的方法。
Dai等[8]建立了19.5 min內提取定量五味子中4種木脂素的方法,設定最佳超臨界流體萃取條件為15 MPa,50 ℃反應4 min,超臨界CO2加入1%甲醇提高流體的極性,洗脫體積為6 mL,流速設置為2 mL·min-1,確認分流率為2.5%。
Liu 等[9]通過UHPE 提取五味子中的木脂素,得到其最佳提取條件為壓力400 MPa,90%乙醇,液固比90∶1,提取時間5 min。相較熱回流提取法和超聲輔助提取法,UHPE 的提取率最高,提取時間最短。此外,UHPE的提取物具有最高的抗氧化活性。
Cheng等[10]通過RSM 優化了STE,以Sch B 等木脂素的提取率為指標,與熱回流法、超聲輔助提取、微波輔助提取等方法進行比較,獲得最佳提取條件為以75%乙醇為提取溶劑,提取電壓為180 V,提取時間為1 min,固液比為1∶19,樣品粒徑為120目。結果表明,STE 可以在最短的提取時間內達到最大的提取效率。
ASE 與相對成熟的公認提取技術相比具有有機溶劑用量少、提取效率高、選擇性高、擁有高自動化的提取技術等優勢,現已在藥物、食品等領域得到廣泛應用。Zhao 等[11]運用三變量Box?Behnken 設計(BBD)的RSM 建模優化了ASE,以提取五味子中的木脂素,得出最佳提取條件為提取溶劑為87%乙醇,溫度160 ℃,靜態提取時間10 min,萃取壓為1.034×109Pa,沖洗液量60%。
在對中藥藥材進行質量評價及藥理活性的深入研究中,分離純化工藝起著至關重要的作用,Sch B分離純化工藝、原理、優缺點見表2。

表2 五味子乙素分離純化工藝總結
硅膠柱層析法(正相色譜法)是通過化學成分極性大小所對應硅膠吸附力的不同來達到物質分離一種常見手段。Zhang 等[4]先采用超聲輔助提取,再通過硅膠柱層析以石油醚?丙酮(95∶5)為洗脫劑,結晶后從400 g藥材粉末中得到純度為99.4%,總回收率為57.1%的Sch B 1.46 g。
Caichompoo 等[12]通過大孔樹脂吸附技術對五味子果實與種子的提取物進行純化,將提取液溶解在30%乙醇中,吸附于AB?8 型大孔樹脂上,依次用30%乙醇和70%乙醇洗脫,70%乙醇洗脫后得到殘留木脂素65.2%。大孔樹脂吸附技術最早用于廢水處理、分析化學等領域中,通過大孔樹脂與吸附質間產生的范德華力達到與其他物質分離的目的。
HSCCC作為一種新型的液?液色譜分離技術,根據色譜理論,可以通過合適的分配系數使樣品各組分。王磊[13]得到了對于五味子木脂素粗品最佳的HSCCC條件:正己烷?甲醇?水(7∶6∶1),上為固定相,下為流動相,轉速為800 r·min-1,流速為2.0 mL·min-1,并首次經HSCCC同時分離了4種活性木脂素成分。
Ma等[14]對傳統的MEKC 進行了優化,建立了毛細管中2,2?疊氮比(3?乙基苯并噻唑啉?6?磺酸)?掃描膠束電動色譜?二極管陣列檢測器方法,通過對掃描及分離參數的調整,將敏感性增強因子調至17~167,檢出限調至6 ng·mL-1,進行天然產物中包括Sch B的微量抗氧化劑篩選和更為精準的定量。
Sch B 含有共軛雙鍵且在570 nm 處有最大吸收。郝書文等[15]利用UV 在570 nm 處測定北五味子與北五味子果梗提取液的光密度,通過繪制標準曲線來定量Sch B 的含量。UV 雖然操作簡單、耗時短,但在專屬性和準確度方面較有局限性。
曹濤等[16]通過TLC 與UV 聯用對自制Sch B 結晶母液進行鑒定,石油醚?乙酸乙酯(20∶5)展開,UV 254 nm 檢視,I2熏顯色,結果表明,硅膠G 薄層色譜板均見單一熒光斑點或棕色斑點,無雜質。
HPLC 即以液體為流動相,將待測樣品經高壓輸液系統泵入固定相色譜柱,經分離后檢測。周艷等[17]通過HPLC 評估了炮制后的五味子各類木脂素的含量差別后發現,炮制品的Sch B 含量不穩定,其余成分均有不同程度的提高。
超高液相色譜法(UPLC)即HPLC 技術上的改革與創新,運用與HPLC 相同的原理,縮短了檢測時間并節省流動相。王會品等[18]使用UPLC 同時對肝復康丸中Sch B 及其他9個成分進行測定,經精密度、穩定性、重復性、加樣回收率等方法學驗證準確有效,為肝復康丸的質量評定提供了方法學支持。
3.4.1 超高速液相色譜?質譜法(UFLC?MS/MS)Shi等[19]通過UFLC?MS/MS對口服加味開心散浸膏的血管性癡呆大鼠模型血漿中的Sch B 等成分進行定量測定,所建立的方法具有較高的精密度和準確性,該藥物代謝動力學研究對中藥方劑的作用機制探索和臨床應用有一定的參考價值。
3.4.2 液相色譜?串聯質譜法(LC?MS/MS)Li等[20]首次建立了一種靈敏、準確的大鼠血漿中對映體定量的LC?MS/MS,分別提取北五味子和南五味子的Sch B 后,口服給藥大鼠,成功對其體內立體選擇性藥物代謝動力學進行研究。
3.4.3 高效液相色譜聯合指紋圖譜檢測法 Wei等[21]基于高效液相色譜?二極管陣列檢測器法(HPLC?PAD),建立HPLC與指紋圖譜聯合的方式對五味子中Sch B 等8種活性成分進行同時測定。結果表明,該方法具有良好的線性關系、精密度、重復性、穩定性和回收率。該研究發現,HPLC 與指紋圖譜聯合對中藥成分的多組分分析具有很大的應用前景,可用于中藥材的質量鑒定。
3.4.4 高效液相色譜?二極管陣列檢測器?質譜法(HPLC?PAD?MS)Liu 等[22]通過優化HPLC 色譜條件和提取工藝,分別比較保留時間、UV 光譜和MS數據,確定樣品HPLC 圖譜中色譜峰的特征,建立了HPLC?PAD?MS,并成功進行了對Sch B等12種木脂素樣品的定量分析和樣品來源的質量評價。
3.4.5 閃蒸?氣相色譜?質譜法(FE?GC?MS)黃翌磊等[23]利用FE?GC?MS 同時定量了中成藥四神丸中的Sch B 等8種有效成分,對各企業生產的藥物進行質量評定,優化后的檢測條件:閃蒸溫度為300 ℃,色譜柱為UA?5(30 m×0.25 mm,0.25 μm),程序升溫條件為初始溫度50 ℃,10 ℃·min-1升到200 ℃,再以5 ℃·min-1升到300 ℃,分析時間10 min。
隨著現代科學技術手段的不斷進步,研究者對Sch B的藥理作用不斷產生新的認知?,F將國內外近年來Sch B 藥理作用研究進展進行匯總,為其深入研究提供參考。
Lin 等[24]通過高糖誘導人微血管內皮細胞HMEC?1、人腦微血管內皮細胞HBMEC和人臍靜脈血管內皮細胞HUVEC?12 損傷,采用蛋白質印跡法和酶聯免疫吸附劑測定來定量Sch B 作用下熱休克蛋白(Hsp27)、凋亡相關蛋白(Noxa)、Toll 受體(TLR5)、磷酸化核轉錄因子?κB(NF?κB)抑制蛋白(p?IκBα)、磷酸化?p65(p?p65)蛋白和腫瘤壞死因子?α(TNF?α)、白細胞介素?6(IL?6)、單核細胞趨化蛋白(MCP?1)、IL?1β的表達。結果顯示,Sch B可以抑制Hsp27 的過表達,下調炎癥細胞因子,進而抑制p65 轉運至細胞核所引起的炎癥級聯反應的發生。Li 等[25]通過葡聚糖硫酸鈉自由飲用建立小鼠潰瘍性結腸炎模型,探究Sch B 對潰瘍性結腸炎(UC)的影響。研究表明,Sch B 可以促進激活黏附斑激酶來保護腸黏膜屏障并有效預防炎癥反應的發生。Ran 等[26]研究發現,Sch B 可以通過細胞NF?κB和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路2 種途徑來改善骨關節炎。Jia 等[27]通過將小鼠暴露于香煙煙霧下建立小鼠肺部炎癥模型,并在給藥Sch B 后定量測定支氣管肺泡灌洗液中炎性介質TNF?α、IL?1β和IL?6 的水平并同時監測了超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)、髓過氧化物酶(MPO)的含量與NF?E2相關因子2(Nrf2)和NF?κB 的表達。結果發現,Sch B通過抑制支氣管肺泡灌洗液中炎癥介質TNF?α、IL?1β和IL?6 的水平,降低了MPO 活性和丙二醛(MDA)含量,同時上調了SOD和GSH的指標,抑制NF?κB活化并上調Nrf2和血紅素氧合酶?1(HO?1)的表達來發揮對小鼠肺部炎癥的抗炎作用。胡素珍等[28]通過香煙煙霧提取物聯合脂多糖(LPS)作用于肺上皮細胞A549,建立慢性阻塞性肺疾?。–OPD)急性加重期體外模型后發現,Sch B 可以顯著改善香煙煙霧提取物聯合LPS 引起的肺上皮細胞炎癥。Lin 等[29]研究了Sch B在LPS 刺激的HUVEC 中的抗炎作用,結果發現,Sch B 可通過激活Nrf2 信號傳導途徑來抑制HUVEC中LPS 誘導的炎癥。Xin 等[30]研究發現,Sch B 通過p53 信號通路以減輕成年大鼠創傷性脊髓損傷誘導的炎癥反應、氧化應激和細胞凋亡。
Sch B 也可以通過其抗炎活性達到抑菌的作用。Guo 等[31]發現,Sch B 可以抑制痤瘡丙酸桿菌感染的人髓系白血病單核細胞THP?1 中炎性小體NLRP3 的激活,繼而有效抑制IL?1β分泌和細胞凋亡,達到抑菌作用。其中,炎性小體3(NLRP3)在痤瘡丙酸桿菌介導的炎癥和細胞凋亡中起重要作用。
Ding等[32]發現,Sch B可以顯著改善叔丁基過氧化氫誘導人永生化表皮角質細胞HaCaT 氧化損傷,引起的細胞死亡,增強抗氧化酶的表達,并通過調節其磷酸化途徑進一步參與Nrf2 信號通路。研究表明,Sch B 可以通過增強內源性抗氧化劑防御系統,進而發揮一定程度的抗氧化作用。Zhu等[33]建立大鼠后肢缺血/再灌注(I/R)損傷模型前給藥Sch B 發現,其可以有效減少I/R 所引起的組織學改變和水腫。研究證實,Sch B通過減輕氧化應激和炎癥來預防大鼠后肢I/R 骨骼肌損傷。吳靖等[34]研究發現,Sch B 可以顯著降低小膠質細胞BV?2 的氧化應激損傷。
Sch B通過其抗氧化作用也可以產生顯著的保肝作用。Feng 等[35]研究證明,Sch B 可被細胞色素P450(CYP450s)酶所代謝,生成在人和鼠肝微粒體中有修飾肽能力的碳烯活性代謝物,其可與Keap1結合激活Nrf2途徑從而減少肝的損傷。Cheng等[36]發現,Sch B 通過抑制內質網應激來抑制利福平誘導的肝細胞損傷。Chen等[37]建立四氯化碳(CCl4)誘導的大鼠肝纖維化模型,并在體外使用大鼠肝星狀細胞HSC?T6評價Sch B對HSC活化的影響。結果表明,Sch B 通過激活Nrf2 介導的抗氧化信號通路和抑制轉化生長因子?β(TGF?β)/Smad,抑制HSC的激活而減輕氧化應激,從而發揮保肝作用。氯氮平(CLZ)在臨床上多用于治療精神分裂癥,但其在發揮治療作用的同時會導致一定程度的肝損傷。白慧媛等[38]通過建立CLZ 誘導的小鼠慢性肝損傷模型來評估Sch B 的保肝作用,結果表示,Sch B 可以通過劑量依賴性方式激活Nrf2/抗氧化反應元件信號通路來預防CLZ誘導的肝損傷。
同時,Sch B也在抗衰老方面表現了強大的藥理活性。仲維莉等[39]為了探討Sch B 對高糖誘導HUVEC的抗衰老作用,采用β?半乳糖苷酶染色法測定其抗衰老功能,流式細胞儀測定細胞周期,并檢測HUVEC 中活性氧、一氧化氮含量。結果發現,Sch B 可延緩高糖誘導的HUVEC 衰老進程,且作用呈劑量依賴性。劉聰等[40]也發現,Sch B 能夠顯著延緩D?半乳糖誘導的小鼠腦衰老。
Nasser 等[41]采用流式細胞儀和蛋白質印跡法檢測后發現,Sch B可以顯著抑制前列腺癌細胞的增殖并促進DU145 和LNCaP 細胞凋亡及S 期細胞的停滯。其數據證明了Sch B 作為前列腺癌的有效藥物的抗腫瘤作用。Dai等[42]為了探究Sch B對三陰性乳腺癌的影響,采用了MDA?MB?231、BT?549、MDA?MB?468TNBC細胞和免疫缺陷小鼠,結果表明,Sch B通過誘導細胞周期停滯和觸發凋亡性死亡來抑制三陰性乳腺癌的發展。Wang 等[43]研究發現,Sch B 可以通過干預患者的2 種耐藥性機制進而實現抗腫瘤作用,即影響藥物外排和抗凋亡作用。Sch B可以顯著提高耐阿霉素(DOX)的乳腺癌和卵巢癌細胞對DOX的敏感性,通過抑制P 糖蛋白的表達和活性來增加DOX 的胞內積累,也可以明顯下調抗凋亡蛋白survivin的表達。彭朝陽等[44]研究表明,Sch B可誘導肝癌細胞HCCLM3 凋亡,降低細胞侵襲及血管新生。李月靈等[45]提出,Sch B 可以抑制胃癌細胞SNU?1 細胞增殖和轉移。戴國梁等[46]發現,Sch B 可以通過影響結腸癌患者血管內皮生長因子(VEGF)信號通路來抑制細胞SW620 的活性和遷移。喬利峰等[47]認為,Sch B 可減弱視網膜母細胞瘤移植癌裸鼠腫瘤生長,提高存活率,降低VEGF的表達。
Qin 等[48]為了探討Sch B 在膜增生性腎病(IgA)大鼠模型中的作用,通過尿中的紅細胞、尿蛋白、血尿素氮和肌酐的水平來評估腎功能,結果發現Sch B可以降低尿中的紅細胞、尿蛋白、血尿素氮和肌酐的水平,顯著改善IgA 腎病大鼠的腎功能。Mou等[49]發現,口服Sch B可以顯著減輕糖尿病小鼠高血糖引起的腎損傷,維持尿肌酐和白蛋白水平,表明Sch B 可能是糖尿病腎病的潛在治療劑。Cao等[50]研究證實Sch B也可以潛在地用于腎小管間質纖維化的治療。順鉑(DDP)的腎毒性限制了其臨床應用。田妮等[51]研究發現,Sch B 對DDP 引起的人類近端腎小管上皮細胞HK?2 損傷具有保護作用。Liu 等[52]研究表明,Sch B 通過激活細胞外信號調節激酶和NF?κB信號傳導以誘導抗凋亡蛋白survivin表達,改善DDP引起的腎功能損傷,從而擴大DDP的臨床應用價值。Lai 等[53]研究證實,Sch B 可以通過抑制氧化應激、細胞凋亡和自噬,防止活性氧(ROS)積累,減輕免疫抑制劑環孢霉素A 的腎毒性??诅鞯萚54]提出,Sch B 對腎缺血再灌注所致急性腎損傷小鼠的腎功能、病理損傷及細胞凋亡情況有一定程度的改善作用。
4.5.1 抗阿爾茨海默病 Zhang等[55]發現,Sch B可以通過抑制β淀粉樣蛋白誘導所引起的SH?SY5Y 神經細胞系損傷,且此過程可能與DNA 甲基化有關。該研究也為Sch B 在阿爾茨海默病潛在治療中的應用提供了數據支持。楊擎等[56]經實驗研究后發現,Sch B可以靶向β蛋白樣蛋白(Aβ)配體并有效促進Aβ寡聚體解聚,抑制神經元的凋亡。Wu 等[57]研究證實,Sch B 可能是潛在的抗氧化應激相關治療劑,可能的機制是通過增強抗氧化劑活性進行神經保護。
4.5.2 鎮靜催眠 Sch B 對中樞神經系統還存在一定程度的鎮靜催眠作用。Li等[58]觀察了Sch B對小鼠鎮靜和催眠作用并探究其機制,結果發現,Sch B可以上調小鼠大腦皮質,海馬和下丘腦中GABAARα1和GABAARγ2基因的表達,并顯著提高小鼠外周血及大鼠大腦皮質、海馬、下丘腦中γ?氨基丁酸(GABA)的水平,降低谷氨酸(Glu)的水平,從而導致GABA/Glu比例增加。
Zhao 等[59]采用冠狀動脈左前降支結扎術建立大鼠I/R損傷模型,測定心肌梗死面積、心肌梗死血清標志物、心肌細胞凋亡指數和絲氨酸/蘇氨酸激酶(Akt)表達,發現Sch B 可以通過磷酸肌醇3 激酶(PI3K)/Akt 信號通路保護大鼠心肌組織免受I/R 損傷。Zhang 等[60]建立大鼠I/R 損傷模型,測試了肌酸激酶、乳酸脫氫酶、MDA 和總SOD 的水平,并采用蛋白印跡法測定了內質網應激相關蛋白的表達,發現Sch B 可通過減少氧化反應并減弱內質網應激誘導的細胞凋亡,從而對心肌細胞起到保護作用。
經研究發現,Sch B有良好的調節脂質代謝的作用。Kwan 等[61]研究發現,Sch B 可以顯著降低飲食誘導肥胖(DIO)小鼠脂肪細胞3T3?L1 和皮下脂肪細胞甘油酯的含量,激活激素敏感性脂肪酶(HSL)發揮脂解作用,同時促進脂肪酸氧化基因的表達,表明Sch B可能對于肥胖癥具有潛在的治療價值。
Sch B 同時也有改善性功能的藥理作用。Liu等[62]通過雙側海綿體壓迫神經損傷建立勃起功能障礙大鼠模型,給藥后對陰莖海綿體內壓(ICP)、環磷酸腺苷(cAMP)、環磷酸鳥苷(cGMP)、內皮型一氧化氮合酶(eNOS)和神經元NOS(nNOS)定量測定發現,ICP 研究中,Sch B 以劑量依賴的方式改善勃起功能障礙(ED)。中高質量濃度Sch B治療組中eNOS 和nNOS 的表達相對較高,除此之外,Sch B 也可以顯著提高cAMP 和cGMP 的表達水平。結果表明Sch B 能夠通過NO?cGMP 和cAMP?蛋白激酶A(PKA)途徑改善大鼠ED。
最新研究發現,Sch B對糖尿病視網膜病變有很大的治療潛力。劉青[63]提出,Sch B 可以通過Cdc42/p38 通路改善鏈脲佐菌素誘導的糖尿病視網膜病變(DR)。此外,Fan 等[64]采用大鼠大腦中動脈閉塞再灌注模型,證實了Sch B 對大鼠腦缺血再灌注損傷的治療作用。
隨著祖國傳統醫學的發展,中藥開始逐步走上了世界的舞臺,越來越多的學者開始關注其更為深入的藥用價值和潛在作用機制,但由于中藥種類的多樣性和成分的復雜性,對中藥的研究也不僅局限于復方配伍應用,中藥單體也日漸成為新型藥物研發的熱點。Sch B作為五味子常見木脂素類成分,具有抗炎、抗氧化、改善腎功能、抗腫瘤、作用于中樞神經系統和心血管系統等藥理活性,目前已被廣泛應用于臨床,活躍于醫療保健市場。隨著現代科技手段的不斷發展,近年來研究熱點不僅局限于抗炎、抗氧化、抗腫瘤等常見藥理活性,其在調節脂質代謝、改善性功能及治療糖尿病視網膜病變等方面的研究也值得深入挖掘。
目前,現代提取工藝已經極大改善了傳統提取方法能耗大、提取率低等缺陷,但仍存在局限性,如何開發更為高效、穩定、便捷、環保、經濟的新興提取工藝和檢測手段就顯得尤為重要。本文對現階段Sch B 的提取工藝、檢測方法和藥理作用的研究進展進行總結,為Sch B 未來創新型藥物的研發及中藥材質量的評定提供參考。