益氣活血通絡方通過抑制P2X7介導的脊髓小膠質細胞活化改善糖尿病大鼠神經病理性疼痛

周家梅，胡光民，程連芝，馬俊龍，王帆競，周 鵬，江愛娟

(1.安徽中醫藥大學中西醫結合學院，安徽 合肥 230012；2.安徽省中醫藥科學院中西醫結合研究所，安徽 合肥 230012)

神經病理性疼痛(diabetic neuropathic pain，DNP)是糖尿病患者常見的慢性并發癥之一，以外周體感異常直接引起的痛覺過敏、自發痛和誘發痛為主要癥狀[1]。以往研究認為，神經病理性疼痛是由神經細胞和神經系統功能的變化引起的。然而，臨床上常用的以神經細胞為靶點的鎮痛藥物療效并不理想，這表明某些非神經細胞因素在神經病理性疼痛的發生過程中發揮著重要作用[2-3]。因此，需要將研究的重點轉移到神經細胞以外的其他細胞的潛在作用上。小膠質細胞是中樞神經系統中重要的免疫細胞，可以監測和穩定周圍環境，有利于神經細胞的營養及修復[4]，在中樞神經系統的生理病理過程中發揮重要作用。

益氣活血通絡方是安徽中醫藥大學第一附屬醫院的院內制劑，其功效是益氣養陰、活血通絡，對糖尿病周圍神經病變患者的四肢麻木、感覺遲鈍和疼痛有較好療效[5-6]，但其作用機制尚未明了。本研究擬通過高脂喂養4周聯合腹腔注射鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)(35 mg/kg)制備DNP大鼠模型[7]，觀察益氣活血通絡方干預后，大鼠的機械痛閾和熱縮足反應時間、大鼠脊髓組織中補體受體-3的單克隆抗體(monoclonal antibody of complement receptor type 3，OX42)和P2X7(purinergic 2X7)的表達情況，探討益氣活血通絡方防治DNP的作用及其分子機制，為其臨床應用提供更充分的科學依據。

1 材料

1.1 動物 80只SD大鼠，健康清潔級，雄性，6周齡，體質量180～210 g，購自南京青龍山動物實驗中心[生產許可證號：SCXK(浙)2014-0001]。所有大鼠自由飲水，室內濕度25%～30%，室內溫度20～25 ℃。

1.2 藥物及試劑 益氣活血通絡方是安徽中醫藥大學第一附屬醫院院內制劑，由黃芪、當歸、雞血藤、生地黃、葛根、延胡索、威靈仙7味中藥材組成，批號 20190228；甲鈷胺片(1712070f)：衛材中國藥業公司；STZ(批號 ez3414B220)：BioFroxx；腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、趨化因子配體3(CC-chemokine ligand 3，CCL3)、白細胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)酶聯免疫試劑盒(批號分別為202101、202101、202101)：江蘇酶免實業公司；BCA蛋白定量試劑盒(批號 PICP123223)：ThermoFisher；ECL顯影試劑(批號 ATSAP2501)：Abbkine；OX42(批號 ab1211)、P2X7(批號 ab109054)：Abcam。

1.3 儀器 血糖儀(5D-2型)：北京怡成；纖維絲測痛儀(Von Frey)：North Coast；智能熱板儀(RB200型)：成都泰盟；凝膠成像分析系統(FCM)：protein simple；水浴鍋(H11210)：Leica；電泳儀(mini protean 3 cell)：BIO-RAD；熒光顯微鏡(ECLIPSE Ni)：NIKON；冰凍切片機(CM1850)：徠克公司；酶聯免疫分析系統(ATOM)：Maroche。

2 方法

2.1 DNP大鼠模型的制備、分組及給藥 80只SD大鼠適應性喂養1周后，隨機選擇12只大鼠作為空白組，以普通飼料喂養，其余大鼠飼喂高脂飼料4周，單次腹腔注射STZ溶液35 mg/kg，72 h后測空腹血糖(fasting blood glucose，FBG)，FBG>11.1 mmol/L認定為2型糖尿病大鼠。2周后，檢測2型糖尿病大鼠機械痛閾和熱縮足反應時間。如果兩者都降低到基本值的85%以下，則確定為DNP模型復制成功大鼠。將DNP大鼠隨機分為5組：模型組，益氣活血通絡方高劑量(9 g/kg，相當于成人臨床用量的18倍)、中劑量(4.5 g/kg)、低劑量(2.25 g/kg)組和陽性對照組，每組12只。益氣活血通絡方高、中、低劑量組分別給予不同劑量益氣活血通絡方灌胃，陽性對照組大鼠予以甲鈷胺(0.175 mg/kg)灌胃，模型組大鼠用等量的生理鹽水灌胃。DNP大鼠模型復制成功時(即給藥前)計為0周，治療組大鼠連續灌胃給藥8周。于治療第0周每組隨機取6只大鼠，禁食不禁水12 h，尾部無菌操作后取靜脈血，血糖儀檢測FBG值后，3只大鼠的L4—L6節段脊髓組織用于Western blot檢測大鼠脊髓中OX42和P2X7蛋白表達水平，3只大鼠的L4—L6節段脊髓組織用于免疫熒光檢測大鼠脊髓中OX42和P2X7蛋白表達水平。每組剩下的6只大鼠于第0、2、4、6、8周測機械痛閾值和熱縮足反應時間。于治療第8周每組取剩下的6只大鼠，禁食不禁水12 h，尾部無菌操作后取靜脈血，血糖儀檢測FBG值后，3只用于Western blot檢測，3只用于免疫熒光檢測。

2.2 大鼠FBG值測定 大鼠于治療第0周和第8周，禁食不禁水12 h，尾部無菌操作后取靜脈血，血糖儀檢測FBG值。

2.3 大鼠機械痛閾測定 于第0、2、4、6、8周，將空白組、模型組和各給藥組大鼠置于篩狀金屬板上，用有機玻璃罩分隔，待大鼠適應后，用纖維絲垂直刺激大鼠右后掌，大鼠出現陽性反應(抬腿躲避或者舔足)。每次間隔15 s，測5次，記錄每次發生陽性反應的最小克數，取其平均值即為該大鼠的機械痛閾值。

2.4 大鼠熱縮足反應時間測定 于第0、2、4、6、8周，將空白組、模型組和各給藥組大鼠放入預熱為52 ℃的智能熱板儀中，在放入時同步進行計時，大鼠舔后足時結束計時，間隔15 min檢測1次，測3次取其平均值為大鼠的熱縮足反應時間。

2.5 ELISA法檢測大鼠血清TNF-α、IL-1β、CCL3水平 給藥第8周末，每組取3只大鼠腹主動脈血，離心，取上清，采用ELISA法，使用試劑盒測定血清TNF-α、IL-1β、CCL3含量。嚴格按照說明書的要求進行操作。

2.6 Western blot法檢測大鼠脊髓中OX42、P2X7蛋白表達水平 給藥第8周末，取大鼠的L4—L6脊髓組織，提取總蛋白，蛋白定量檢測(BCA法)后，經SDS-PAGE垂直凝膠電泳，濕轉法將蛋白轉到NC膜上，5%脫脂奶粉常溫封閉NC膜2 h，結束后分別加入OX42、P2X7和β-actin內參的特異性一抗，4 ℃孵育過夜，次日加入對應二抗常溫孵育2 h后，按ECL顯影試劑說明，在凝膠成像系統中自動顯影。

2.7 免疫熒光檢測大鼠脊髓中OX42、P2X7的表達水平 給藥第8周末，各組大鼠于麻醉、4%多聚甲醛心臟灌注后，取L4—L6節段脊髓組織，獲得冰凍切片。切片經血清封閉30 min后，滴加OX42或P2X7于4 ℃冰箱中孵育過夜，次日避光滴加熒光二抗，于37 ℃孵育1 h，封片后熒光顯微鏡下觀察各組大鼠脊髓小膠質細胞中OX42和P2X7的顯色情況，使用Image J計算OX42和P2X7各自的熒光強度。

3 結果

3.1 益氣活血通絡方對DNP大鼠FBG的影響 給藥前(第0周)，與空白組比較，模型組和各治療組大鼠FBG顯著上升(P<0.05)，但模型組和各治療組大鼠FBG差異無統計學意義(P>0.05)。干預8周后，與空白組比較，模型組和各治療組大鼠FBG顯著上升(P<0.05)；與模型組比較，益氣活血通絡方各劑量組和陽性對照組大鼠FBG水平差異無統計學意義(P>0.05)。見圖1。

注：A.空白組；B.模型組；C.益氣活血通絡方高劑量組；D.益氣活血通絡方中劑量組；E.益氣活血通絡方低劑量組；F.陽性對照組；與空白組比較，*P<0.05

3.2 益氣活血通絡方對DNP大鼠機械痛閾的影響 給藥前(第0周)，與空白組比較，模型組和各治療組大鼠機械痛閾均顯著下降(P<0.05)，模型組和各治療組大鼠機械痛閾差異無統計學意義(P>0.05)。第2、4、6、8周后，與空白組比較，模型組機械痛閾顯著下降(P<0.05)；與模型組比較，益氣活血通絡方各劑量組和陽性對照組機械痛閾均顯著上升(P<0.05)。見圖2。

注：A.空白組；B.模型組；C.益氣活血通絡方高劑量組；D.益氣活血通絡方中劑量組；E.益氣活血通絡方低劑量組；F.陽性對照組；與空白組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

3.3 益氣活血通絡方對DNP大鼠熱縮足反應時間的影響 給藥前(第0周)，與空白組比較，模型組和各治療組大鼠的熱縮足反應時間均顯著縮短(P<0.05)，但模型組和各治療組大鼠熱縮足反應時間差異無統計學意義(P>0.05)。第2、4、6、8周后，與空白組比較，模型組大鼠熱縮足反應時間顯著縮短(P<0.05)；與模型組比較，益氣活血通絡方各劑量組和陽性對照組熱縮足反應時間均顯著延長(P<0.05)。見圖3。

注：A.空白組；B.模型組；C.益氣活血通絡方高劑量組；D.益氣活血通絡方中劑量組；E.益氣活血通絡方低劑量組；F.陽性對照組；與空白組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

3.4 益氣活血通絡方對DNP大鼠血清TNF-α、IL-1β、CCL3水平的影響 治療8周后，與空白組比較，模型組大鼠血清TNF-α、IL-1β、CCL3水平顯著上升(P<0.05)；與模型組比較，益氣活血通絡方高、中劑量組和陽性對照組大鼠血清TNF-α水平均顯著下降(P<0.05)，低劑量組大鼠血清TNF-α水平有所下降，但差異無統計學意義(P>0.05)；益氣活血通絡方各劑量組和陽性對照組大鼠血清IL-1β、CCL3水平均顯著下降(P<0.05)。見圖4。

圖4 益氣活血通絡方對DNP大鼠血清TNF-α、IL-1β、CCL3水平的影響

3.5 益氣活血通絡方對DNP大鼠脊髓組織OX42和P2X7表達水平的影響 Western blot結果顯示，第8周末，與空白組比較，模型組大鼠脊髓組織中OX42、P2X7蛋白表達水平均顯著上升(P<0.05)；與模型組比較，益氣活血通絡方中劑量組和陽性對照組大鼠脊髓組織中OX42蛋白表達水平均顯著下降(P<0.05)，益氣活血通絡方各劑量組和陽性對照組大鼠脊髓組織中P2X7蛋白表達水平均顯著下降(P<0.05)。見圖5。

圖5 益氣活血通絡方對DNP大鼠脊髓組織OX42、P2X7蛋白表達水平的影響

免疫熒光結果顯示，與空白組比較，模型組大鼠脊髓組織中OX42(綠色)和P2X7(紅色)熒光強度顯著增強(P<0.05)；與模型組比較，益氣活血通絡方各劑量組和陽性對照組大鼠脊髓組織中OX42、P2X7熒光強度顯著下降(P<0.05)。見圖6、圖7。

注：A.空白組；B.模型組；C.益氣活血通絡方高劑量組；D.益氣活血通絡方中劑量組；E.益氣活血通絡方低劑量組；F.陽性對照組

注：A.空白組；B.模型組；C.益氣活血通絡方高劑量組；D.益氣活血通絡方中劑量組；E.益氣活血通絡方低劑量組；F.陽性對照組；與空白組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

4 討論

有研究[8]報道，2019年全球有4.63億糖尿病患者(20～79歲)，中國糖尿病患者總數為1.16億，居首位。而20%～30%糖尿病患者最終伴發DNP，DNP會導致不同程度的身體殘疾，且長期的慢性疼痛會導致失眠、抑郁、焦慮等癥狀[1]，嚴重降低患者的生活質量，這是疼痛研究領域的一個熱點和難點課題。

目前，DNP的發病機制尚未完全闡明，臨床暫無特效藥物，一般只能在控制血糖的同時給予止痛、營養神經和改善微循環等對癥支持治療，這能起到一定的治療和緩解作用，但在改善患者全身癥狀方面療效不理想。常用的藥物為抗癲癇藥(普瑞巴林、加巴噴丁等)和抗抑郁藥(度洛西汀、阿米替林等)，雖然能有效緩解癥狀，但帶來的不良反應常常是患者所無法承受的[9]。中藥的多靶點性與DNP本身的復雜性決定了中藥復方在治療此病的獨特優勢。

OX42作為小膠質細胞活化的表面標志物，是小膠質細胞常用且具有高度特異的表面標志物[10]。當周圍神經受損傷時，小膠質細胞會發生形態改變伴隨OX42的表達增加，與神經病理性疼痛的發生密切相關[11]。越來越多的研究發現，小膠質細胞上的嘌呤能信號在神經病理性疼痛的發病機制中起著重要作用。在周圍神經損傷后，小膠質細胞被激活，形態和功能發生變化，細胞數量增加，同時嘌呤P2X7受體基因表達上調[12-13]。P2X7受體是P2嘌呤能受體的一個亞型，感覺神經末梢釋放的受體激動劑(包括ATP及其衍生物)可與P2X7受體結合，使感受器活化，介導疼痛的感覺和傳導[14-15]，在炎癥性疼痛和神經性疼痛的發展中都發揮著重要作用[16-17]。Wu等[18]認為，P2X7在神經病理性疼痛中充當內源性激動劑的作用。P2X7受體特異性阻滯劑(如a-438079和a-740003)可降低DNP大鼠的疼痛反應[19-20]。小鼠的P2X7受體基因被敲除后，小鼠對疼痛的超敏反應在神經損傷后消失[21]。此外，P2X7受體的高表達也能促進脊髓背角小膠質細胞CCL3的釋放[22]。在對STZ誘導的DNP模型大鼠的研究發現，脊髓背角組織中CCL3和P2X7受體的高表達參與痛覺過敏的產生[23]。上述結果表明，P2X7受體參與神經病理性疼痛的產生，阻斷P2X7受體的活化可能是緩解神經疼痛的有效方法。小膠質細胞中高表達的P2X7受體也在小膠質細胞激活和隨后釋放促炎細胞因子(包括IL-1β和TNF-α)中起關鍵作用[24]。大量實驗證實慢性低度炎癥在DNP的發生發展中起著極其重要的作用[5-6]。其中，TNF-α是參與糖尿病神經病變的關鍵炎癥因子[25]。綜上所述，降低P2X7的表達可以抑制炎癥反應，發揮神經保護作用，緩解神經性疼痛。

本研究發現，DNP大鼠的機械痛閾和熱縮足反應時間顯著降低，脊髓小膠質細胞中OX42和P2X7表達水平顯著增加，血清中炎癥遞質IL-1β、TNF-α和CCL3的水平也顯著升高。這提示STZ誘導的糖尿病大鼠周圍神經損傷后，脊髓內的小膠質細胞活性明顯升高并伴隨P2X7表達水平上調。益氣活血通絡方干預后，機械痛閾和熱縮足反應時間顯著升高，說明益氣活血通絡方確實能改善DNP模型大鼠周圍神經的功能，緩解其疼痛癥狀。脊髓組織中OX42和P2X7表達水平降低，血清TNF-α、IL-1β和CCL3水平亦明顯下降，說明益氣活血通絡方可通過降低小膠質細胞活性，下調P2X7的表達水平，抑制炎癥因子和趨化因子的釋放，從而改善周圍神經損傷并減輕神經病理性疼痛。綜合課題組前期和本次的研究結果，藥物的劑量依賴性趨勢并不顯著[7]，還需進一步探索。

本實驗研究了中藥復方益氣活血通絡方防治DNP的功效和機制，為下一步通過網絡藥理學等方法進一步闡明益氣活血通絡方干預DNP提供了有效依據，為中醫藥治療糖尿病并發癥提供科學依據和有效選擇。