基于網絡藥理學研究桃紅四物湯干預腰椎間盤突出癥的機制

喬明珠，呂 浩，江 渟

(1.安徽中醫藥大學研究生院，安徽 合肥 230012；2.安徽中醫藥大學第一附屬醫院骨傷一科，安徽 合肥 230031)

腰椎間盤突出癥(lumbar disc herniation，LDH)是一種常見的骨關節病，也是誘發腰痛的主要原因之一。其基本病理變化為腰椎間盤退行性變，纖維環部分或全部破裂，隨即髄核(nules pulposus,NP)突出或脫出[1-2]。LDH可歸屬于中醫學“腰腿痛”或“痹病”范疇。臨床常用活血化瘀類藥物治療[3-4]。桃紅四物湯首見于《醫宗金鑒·婦科心法要訣》，由桃仁、紅花、當歸、熟地黃、白芍和川芎組成，組方嚴謹。近代醫家在繼承傳統的基礎上將其廣泛應用于內科、皮膚科和骨傷科等疾病[5-7]。本研究采用生物信息學分析方法對桃紅四物湯干預LDH的主要活性成分、作用靶點及信號通路進行篩選，揭示其作用機制，為桃紅四物湯治療LDH提供依據。

1 資料與方法

1.1 桃紅四物湯有效化學成分及作用靶點的檢索 通過中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform,TCMSP)尋找桃仁、紅花、熟地黃、當歸、白芍、川芎6味中藥的有效化學成分，對口服利用度(oral bioavailability,OB)≥30%且類藥性(drug-likeness,DL)≥0.18的活性成分進行初步篩選，獲得活性化合物及其作用的蛋白質靶點，并根據已發表的文獻報道補充與活性化合物相關的已知靶點。篩選完成后，在Uniprot蛋白質數據庫中對化合物的作用靶點進行規范化。

1.2 LDH疾病相關靶點篩選 以“Lumbar disc herniation”為關鍵詞依次查詢GeneCards(https://www. genecards.org)、人類孟德爾遺傳在線(online mendelian inheritance in man,OMIM)、療效靶點數據庫(therapeutic target database,TTD)、DRUGBANK(https://www.drugbank.ca)數據庫，尋找治療LDH的潛在靶點，整合4個疾病數據庫中靶點，得到治療LDH的靶點。

1.3 桃紅四物湯與LDH共有靶點的確定 將桃紅四物湯的藥物靶點和LDH的靶點進行分析，匯總后取交集，確定藥物與疾病的共同靶點。借助Venny 2.1在線繪圖軟件制作共同靶點文氏圖。

1.4 桃紅四物湯與LDH可視化網絡的建立 使用STRING數據庫在線平臺(http://string-db.org)分析LDH與桃紅四物湯共有靶點，獲得蛋白互作網絡圖，以tsv格式導出。將文件代入到R軟件編寫程序中，以靶點蛋白之間的作用次數為參考，定義互作關系多的蛋白為核心蛋白，并制作條形圖。將蛋白相互作用(protein-protein interaction,PPI)的網絡檢索結果導入Cytoscape 3.8.2軟件，調整節點(node)和邊(edge)，形成可視化網絡。

1.5 桃紅四物湯干預LDH的基因通路富集分析 將共有靶點代入R軟件編寫的基因通路富集分析程序，對桃紅四物湯干預LDH的蛋白質靶點進行通路富集和生物過程注釋，獲得顯著富集的信號通路(P<0.05)，運用Cytoscape 3.8.2軟件獲得富集靶點的信息以及相關通路。根據分析結果，獲取前20條通路，選擇與研究的問題最相關的通路，結合基因表達水平變化的程度，對相關基因進行分析。

2 結果

2.1 桃紅四物湯的化學成分篩選結果 根據OB≥30%且DL≥0.18，對檢索到的活性成分進行篩選，共得到已驗證的桃紅四物湯活性成分69個，其中桃仁、紅花、熟地黃、當歸、白芍、川芎的活性成分數量分別為23、22、2、2、13、7個。根據OB值列出排在前10位的藥物活性成分，見表1。

表1 桃紅四物湯中OB值排在前10位的有效化學成分

2.2 桃紅四物湯干預LDH的靶點預測結果 共獲取藥物靶點446個，其中桃仁、紅花、熟地黃、當歸、白芍、川芎的作用靶點數量分別為47、205、30、50、86、28個，匯總并去掉重復的靶點后共獲得235個靶點。檢索4個疾病數據庫后共獲得LDH的相關靶點1 990個，匯總并去掉重復的靶點后共獲得1 243個靶點。將235個藥物成分靶點與1 243個LDH靶點輸入Draw Venny Diagram在線軟件，繪制韋恩圖，取交集后獲得二者共有靶點82個。

2.3 桃紅四物湯干預LDH的活性成分-靶點模型構建 借助Cytoscape 3.8.2軟件構建桃紅四物湯干預LDH的可視化“活性成分-靶點模型”。見圖1。

注：TR、HH、SD、DG、BS、CX分別代表桃仁、紅花、熟地黃、當歸、白芍、川芎，圓形結點代表不同藥物的活性成分，中間矩形代表LDH的靶點

2.4 PPI網絡構建以及核心蛋白確定 將桃紅四物湯與LDH共有的82個交集靶點上傳至STRING數據庫平臺，進一步分析后得到PPI網絡圖，見圖2。

注：圖中線條代表蛋白質與蛋白質相互作用關系，連接靶點的線條數量與該靶點作為潛在靶點的可能性呈正相關

根據PPI網絡中的連接結果，借助條形圖進行可視化，可以得出腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF)、激活蛋白1(activator protein 1,JUN)、表皮生長因子(epidermal growth factor, EGF)、表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(serine/threonine-protein kinase 1, AKT1)與其他基因聯系最密切，為PPI網絡中的核心基因。見圖3。

圖3 桃紅四物湯干預LDH的關鍵靶點條形圖

2.5 采用基因本體論(gene ontology,GO)對桃紅四物湯干預LDH的靶點進行功能富集分析 運用R3.6.1軟件分析排在前10位的生物學過程(biological process,BP)、細胞組成(cellular component,CC)及分子功能(molecular function,MF)。生物學過程涉及對DNA結合轉錄因子活性的調節、對脂多糖的反應、對細菌來源分子的反應等；細胞組成涉及轉錄調節復合體、RNA聚合酶Ⅱ轉錄調節復合物、囊泡腔及分泌顆粒腔等；分子功能涉及DNA轉錄因子結合、受體活性、細胞因子活性等。見圖4。

注：富集基因的數量由氣泡節點的大小表示，其紅色的程度代表顯著狀況

2.6 采用京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)對桃紅四物湯干預LDH的靶點進行通路富集分析 運用R3.6.1軟件和Cytoscape 3.8.2軟件進行KEGG通路富集分析和治療靶點-信號通路網絡圖的構建，得出桃紅四物湯作用于LDH的靶點主要富集于絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)通路、晚期糖基化終末產物(advanced glycation end product，AGE)-AGE受體(receptor for AGE，RAGE)通路、TNF通路等。見圖5。

圖5 桃紅四物湯干預LDH的靶點的KEGG通路富集分析

3 討論

中藥復方具有藥味多、成分復雜、作用靶點多等特點，采用傳統方法探究中藥復方的作用機制尚有一定難度。生物信息學方法為從分子水平探討中藥復方的作用機制提供了機遇。腰痛是導致殘疾的主要原因，約70%的人一生中會經歷腰痛[8]。椎間盤退行性變是導致LDH發病的基本原因，其誘發機制尚不清楚，但細胞外基質(extracellular matrix，ECM)降解、炎癥和細胞凋亡是導致LDH的常見原因[2]。當椎間盤開始退變時，細胞功能逐漸失衡，NP細胞含水量下降，NP細胞和纖維環內的膠原蛋白含量降低，ECM降解。基質金屬蛋白酶(matria metalloproteinases,MMP)含量增加，炎癥遞質釋放，致使椎間盤生物力學性能降低，纖維環變弱，甚至破裂。近年來針對LDH的手術更多地由開放式向微創轉變，但手術可導致硬膜、神經根、大血管損傷，全身麻醉可導致不良反應，且術后恢復時間長、手術成本高，因此患者較難接受手術治療。保守治療仍是大多數LDH患者的首選治療方法[9]。中醫學認為，LDH的病機分為虛實兩端：腎虛可致腰府失養，從而引起腰痛不能轉側；風寒濕邪外襲，經脈困阻，氣血運行不暢，不通則痛。臨床研究[10]表明，桃紅四物湯配合椎間盤鏡微創手術治療LDH后，患者的腰椎活動度、直腿抬高角度、神經功能改善情況明顯優于單純手術治療。桃紅四物湯加減配合射頻消融髓核成形術可促使患者血常規指標恢復，疼痛明顯緩解[11]。桃紅四物湯能夠顯著降低LDH患者炎癥因子水平，改善臨床癥狀體征[12-13]。可見，桃紅四物湯具有活血化瘀、消腫散結、疏通經絡的作用，治療LDH的臨床療效確切。

借助Cytoscape構建藥物的活性成分與疾病的靶點網絡，結果顯示桃紅四物湯干預LDH具有多靶向的特點。在PPI網絡中構建藥物-靶點蛋白模型，對藥物靶點和疾病靶點之間的關系進行可視化分析，得出TNF、JUN、EGF、EGFR、AKT1等為桃紅四物湯干預LDH的核心靶點。TNF作為人體免疫反應的關鍵遞質，可以調控免疫系統、細胞存活的信號通路，以及調節增殖代謝過程[14]。研究[15-16]表明，桃紅四物湯對炎癥因子、免疫活性因子具有調節作用。JUN作為AP-1轉錄因子家族的成員，對細胞外的各種刺激具有功能作用，JUN可促進NP細胞增殖，減少NP細胞凋亡，增加NP細胞的ECM合成，下調炎癥因子水平[17]。通過激活AKT通路可以抑制NP細胞凋亡[18-19]。

GO生物富集分析結果顯示，桃紅四物湯干預LDH主要通過DNA結合轉錄因子活性、氧化應激反應以及對營養水平的反應。椎間盤開始退變時，細胞性能逐漸不穩定、纖維環膠原蛋白在結構和性質上發生改變，促使NP細胞內水分含量減少、蛋白多糖比例下降以及炎癥遞質大量釋放。炎癥細胞因子是炎癥反應的產物，也意味著炎癥級聯反應被激活。隨著退行性變進一步加深，NP細胞釋放的促炎細胞因子也越來越多，如TNF-α、白細胞介素(interleukin,IL)-1β和IL-6[20]，這些細胞因子能夠促進ECM降解[21-23]。

KEGG信號通路分析結果顯示，與LDH密切相關的通路包括MAPK信號通路、TNF信號通路和AGE-RAGE通路等。TNF信號通路可以調節免疫反應、炎癥反應、細胞凋亡和腫瘤發生等眾多生物學活動[24]。近年來，有大量證據表明，TNF-α可刺激多種MMP和具有血小板反應素基序的溶栓素和金屬蛋白酶(a disintegrin and metalloprotease with thrombospondin motifs，ADAMTS)的表達，主要通過核轉錄因子-κB(nuclear factor-κB, NF-κB)/MAPK信號通路誘導這些酶的表達[25]。MAPK通路主要參與細胞生長、發育、增殖以及分化等多個生理、病理過程[26]。Huang等[20]通過檢測細胞外調節蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)的表達，明確IL-33/ST2信號通路對LDH的鎮痛作用和對炎癥遞質的調節作用是通過MAPK和NF-κB通路激活的。LDH患者的黃韌帶細胞經受氧化應激反應后，可快速激活AKT、JNK和p38 MAPK通路，觸發信號級聯后，增強了炎癥和纖維化標志物的表達[27]。AGE通過與RAGE結合，產生炎癥前細胞因子、活性氧誘導炎癥和免疫抑制，活化半胱天冬蛋白酶3和MMP等的表達[28]。桃紅四物湯含藥血清可下調β3整合素、MMP和P38，激活FAK/MAPK信號表達[29]。王偉軍等[30]通過數據分析與實驗驗證桃紅四物湯可以通過參與炎癥相關的NF-κB通路和凋亡通路調控關鍵蛋白的表達，發揮抗炎、抗氧化應激作用。此外，LDH的發病及其相關信號通路主要涉及應激條件下細胞的免疫調節、炎癥反應和細胞凋亡過程[31]。以上相關研究結果與本次分析結果基本相同，提示桃紅四物湯對LDH具有確切療效。

本研究表明，桃紅四物湯中活性化合物可調節多種信號通路和作用于不同靶點，從而發揮治療LDH的作用。由于本研究采用生物信息學分析方法，結果建立在模型預測基礎上，因此所篩選的關鍵靶點、信號通路還需進行實驗驗證。