白堅(jiān)木堿類二聚體在Caco-2細(xì)胞模型中的吸收機(jī)制研究

王重陽，李 潔，王夢文，陶福林，朱文濤，汪電雷

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥 230012；2.肇慶學(xué)院，廣東 肇慶 526061)

白堅(jiān)木堿類生物堿是單萜吲哚生物堿家族中最為龐大的生物堿，因其潛在的細(xì)胞毒性，可以用來開發(fā)其抗腫瘤的作用[1-2]。白堅(jiān)木堿類及其白堅(jiān)木堿類二聚體，是活性的吲哚生物堿中抗腫瘤活性的基本骨架之一。最近有研究[3]從薄葉山橙中再次發(fā)現(xiàn)了新的白堅(jiān)木堿類二聚體(10-dehydroxyl-12-demethoxy-conophylline)成分，代碼命名為“wtdr-11”(見圖1)，其對體外的腫瘤細(xì)胞株(HL-60，SMMC-7721、A-549、MCF-7、SW480)具有顯著的抑制作用。進(jìn)一步的研究表明，wtdr-11活性成分通過抑制Wnt信號通路(IC50=0.21、0.45 μmol/L)發(fā)揮其抗腫瘤活性[4]，與微管蛋白抑制劑長春堿類成分的結(jié)構(gòu)、機(jī)制完全不同[5]，這提示wtdr-11對腫瘤細(xì)胞的選擇性更好、對正常細(xì)胞的毒性更低。課題組前期采用超高效液相色譜-熒光法(ultra-high performance liquid chromatography-fluorescence，UPLC-FLR)測定wtdr-11在大鼠體內(nèi)的藥物代謝動力學(xué)[6]，wtdr-11在大鼠體內(nèi)分布廣泛，主要分布在腎、肺和肝這些血流量較大的器官組織內(nèi)，大鼠灌胃給藥的絕對生物利用度為11.55%，然而wtdr-11在人類結(jié)腸癌細(xì)胞系Caco-2細(xì)胞中吸收特性仍不清楚。為探究該生物堿在腸道的低生物利用度和吸收機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)選用體外Caco-2細(xì)胞模型[7-8]模擬藥物的口服給藥途徑，考察wtdr-11在Caco-2細(xì)胞中的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制。

圖1 新的白堅(jiān)木堿類二聚體(wtdr-11)

1 材料

1.1 試藥 wtdr-11(純度>99.0%)由中國科學(xué)院昆明植物研究所提供；胰酶、二甲基亞砜、熒光黃和青霉素-鏈霉素(100 IU/mL青霉素，100 μg/mL鏈霉素)：北京索萊寶科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基(高糖)：美國HyClone公司；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)：德國Serana公司；漢克平衡鹽溶液(Hank’s balanced salt solution，HBSS)：中國上海興科生物公司；磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffer solution，PBS)：北京中商金橋生物公司；Transwell板：美國Corning公司；堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性檢測試劑盒：上海生物科技有限公司；甲醇色譜純：德國Merck公司；實(shí)驗(yàn)水是Milli-Q超純水，其他試劑均為分析純。

1.2 儀器 5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱：美國賽默飛世爾公司；倒置顯微鏡XSP-15CE：上海立光精密儀器有限公司；TDL-5低速離心機(jī)：中國上海飛鴿公司；高壓蒸汽滅菌鍋LDZX-50KAS：上海三申醫(yī)療器械有限公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；熒光分光光度計(jì)：日本日立公司；-20 ℃冰箱：中科美菱低溫技術(shù)有限公司；超高效液相色譜儀：美國Waters公司；Kinetex C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)：美國菲羅門公司。

1.3 細(xì)胞株 人結(jié)腸癌細(xì)胞系Caco-2：賽齊上海生物工程有限公司，本實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞代數(shù)為10～15代。

2 方法

2.1 Caco-2細(xì)胞模型液wtdr-11定量分析方法的建立

2.1.1 色譜條件及其專屬性 UPLC色譜條件：Kinetex C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流動相：甲醇-水(75∶25)；流速：0.2 mL/min；檢測器：FLU檢測器；熒光激發(fā)波長：330 nm； 熒光發(fā)射波長：439 nm； 柱溫：25 ℃；靈敏度：0.001 AUFS，進(jìn)樣量：2 μL。在該條件下wtdr-11的色譜峰與相鄰基線分離度較好，峰形對稱。

2.1.2 wtdr-11標(biāo)準(zhǔn)曲線建立 將wtdr-11儲備液用HBSS液分別稀釋成 0.1、1、2、5、10、20 μg/mL的質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液，渦旋混合后，取上清液進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以峰面積(Y)與質(zhì)量濃度(X)作線性回歸，計(jì)算回歸方程。

2.1.3 wtdr-11穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密稱取wtdr-11標(biāo)準(zhǔn)品，用HBSS液稀釋成10 μg/mL，置于37 ℃恒溫水浴槽中保溫，分別于0、0.5、1、1.5、2、3 h取樣渦旋混合后，取上清液進(jìn)樣測定，記錄峰面積。

2.1.4 wtdr-11精密度實(shí)驗(yàn) 取wtdr-11線性范圍內(nèi)1、5、10 μg/mL低、中、高3個(gè)濃度的樣品，按“2.1.1”項(xiàng)下操作，每個(gè)濃度樣品制備5份，于1 d內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣測定5次考察日內(nèi)精密度，于1 d內(nèi)進(jìn)樣測定1次，連續(xù)5 d進(jìn)樣測定考察日間精密度。

2.1.5 wtdr-11回收率實(shí)驗(yàn) 取wtdr-11線性范圍內(nèi)1、5、10 μg/mL低、中、高3個(gè)濃度的樣品，按“2.1.1”項(xiàng)下操作并記錄相應(yīng)峰面積。將wtdr-11峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，即得wtdr-11的實(shí)際加入的濃度，以檢測濃度與配制濃度之間的比例，計(jì)算回收率。

2.2 Caco-2細(xì)胞的培養(yǎng) Caco-2細(xì)胞在含10%(V/V)FBS、100 IU/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中于37 ℃、5% CO2、相對濕度90%下培養(yǎng)。每隔2 d用PBS(37 ℃，pH 7.4)沖洗細(xì)胞1次，去除未貼壁細(xì)胞，加入新鮮的完全培養(yǎng)液維持細(xì)胞生長。當(dāng)培養(yǎng)瓶中細(xì)胞生長至80%～90%對數(shù)生長期時(shí)，用胰酶消化液處理，按1∶3的比例傳代，本實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞代數(shù)為10～15代。

2.3 MTT法測定wtdr-11對Caco-2細(xì)胞毒性作用[9]用胰酶消化對數(shù)生長期的Caco-2細(xì)胞，加入完全培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，以每孔5×104個(gè)細(xì)胞密度均勻接種于96孔板中，于5% CO2、37 ℃下培養(yǎng)24 h。wtdr-11預(yù)溶于DMSO中，再用DMEM稀釋成系列濃度(0.1、1、5、10、20、30 μg/mL)溶液。每個(gè)濃度設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞與wtdr-11孵育24 h后，每孔加入20 μL MTT溶液(5 mg/mL)，37 ℃再孵育3.5 h。棄去上清液，每孔加入150 μL DMSO。將板低速輕輕搖動10 min，使甲瓚充分溶解，使用酶標(biāo)儀在490 nm處測量各孔的吸光度(A)值。未接種細(xì)胞的孔作為空白對照，含有細(xì)胞但無樣品溶液的孔作為陰性對照。

2.4 wtdr-11在Caco-2細(xì)胞中的攝取[10-11]

2.4.1 樣品處理方法 將細(xì)胞裂解液加入等容積的甲醇中，渦旋30 s，14 000 r/min離心10 min，取上清液進(jìn)樣分析。

2.4.2 攝取細(xì)胞模型的建立 用胰酶消化對數(shù)生長期細(xì)胞，加入完全培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，以3×105個(gè)細(xì)胞密度接種在12 孔板上，于5% CO2、37 ℃下培養(yǎng)7 d。

2.4.3 時(shí)間依賴性攝取實(shí)驗(yàn) 給藥前，將各孔加入1 mL 37 ℃的HBSS溶液蕩洗細(xì)胞表面培養(yǎng)基，棄去清洗液，37 ℃孵育不同時(shí)間間隔(15、30、60、90、120、180 min)后，吸出藥液，HBSS蕩洗3次后加入500 μL Triton X-100細(xì)胞裂解液，-80 ℃反復(fù)凍融3次，得細(xì)胞裂解液，按“2.4.1”項(xiàng)處理。

2.4.4 濃度依賴性攝取實(shí)驗(yàn) 將wtdr-11溶解于HBSS中，配制濃度為2.5、5、10、15、20 μg/mL的藥物溶液。給藥前，37 ℃ HBSS溶液蕩洗細(xì)胞表面培養(yǎng)基，棄去清洗液。各孔加入1 mL不同濃度的藥物溶液37 ℃孵育60 min，HBSS蕩洗3次后加入500 μL Triton X-100細(xì)胞裂解液，-80 ℃反復(fù)凍融3次，得細(xì)胞裂解液，按“2.4.1”項(xiàng)處理。

2.4.5 pH值依賴性攝取實(shí)驗(yàn) 將wtdr-11溶于不同pH值(5，6，7.4，8)的HBSS溶液。給藥前，37 ℃ HBSS溶液蕩洗細(xì)胞表面培養(yǎng)基，棄去清洗液。各孔加入1 mL不同pH值的藥物溶液，37 ℃孵育60 min，HBSS蕩洗3次后加入500 μL Triton X-100細(xì)胞裂解液，-80 ℃反復(fù)凍融3次，得細(xì)胞裂解液，按“2.4.1”項(xiàng)處理。

2.4.6 溫度依賴性攝取實(shí)驗(yàn) 將wtdr-11溶解于HBSS中，配制濃度為20 μg/mL的藥物溶液。給藥前，37 ℃ HBSS溶液蕩洗細(xì)胞表面培養(yǎng)基，棄去清洗液。各孔加入1 mL pH為7.4濃度為20 μg/mL的藥物溶液，分別于不同溫度(4、25、37 ℃)下孵育60 min，HBSS蕩洗3次后加入500 μL Triton X-100細(xì)胞裂解液，-80 ℃反復(fù)凍融3次，得細(xì)胞裂解液，按“2.4.1”項(xiàng)處理。

2.4.7 P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)抑制劑對Caco-2細(xì)胞吸收wtdr-11的影響 給藥前，37 ℃的HBSS溶液蕩洗細(xì)胞表面培養(yǎng)基，棄去清洗液。在孔內(nèi)加入wtdr-11 (20 μg/mL)、維拉帕米(25 μg/mL)和環(huán)孢素A(10 μg/mL)藥液，并與細(xì)胞共同孵育60 min(pH為7.4，溫度為37 ℃)，HBSS蕩洗3次后加入500 μL Triton X-100細(xì)胞裂解液，-80 ℃反復(fù)凍融3次，得細(xì)胞裂解液，按“2.4.1”項(xiàng)處理。

2.5 wtdr-11在Caco-2細(xì)胞中的轉(zhuǎn)運(yùn)

2.5.1 Caco-2細(xì)胞模型的建立 用胰酶消化對數(shù)生長期的Caco-2 細(xì)胞，加入完全培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，以3×105個(gè)細(xì)胞密度接種在12孔Transwell板中，細(xì)胞刷狀緣側(cè)(apical，AP)加入0.5 mL細(xì)胞懸液，細(xì)胞基底側(cè)(basolateral，BL)加1.5 mL完全培養(yǎng)液，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液，重復(fù)1周，第8天開始，每天換液，培養(yǎng)至21 d。

2.5.2 Caco-2細(xì)胞模型單層膜完整性評價(jià)[12]通過檢測膜兩側(cè)ALP活性和熒光黃的透過率判斷模型是否符合轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)要求。

Caco-2細(xì)胞膜兩側(cè)ALP活性的測定：當(dāng)Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)至21 d時(shí)，測定AP和BL側(cè)ALP的活性。用空白HBSS液小心沖洗Transwell小室的上層和下層，并37 ℃孵育20 min。收集兩側(cè)的樣品溶液，依照ALP試劑盒說明書測定Caco-2細(xì)胞兩側(cè)的ALP酶活性。

Caco-2細(xì)胞膜熒光黃透過量的測定：當(dāng)Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)至21 d時(shí)，測定Caco-2細(xì)胞中熒光黃透過量。Caco-2細(xì)胞單層用預(yù)熱37 ℃的HBSS清洗3次后，AP側(cè)加入0.5 mL 20 μg/mL熒光黃，BL側(cè)加入1.5 mL HBSS溶液，置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 h后，取BL側(cè)溶液0.5 mL，用熒光分光光度計(jì)檢測熒光強(qiáng)度(激發(fā)波長427 nm，發(fā)射波長536 nm)，計(jì)算熒光透過率，并由公式計(jì)算熒光黃的細(xì)胞模型的表觀滲透系數(shù)(apparent permeability coefficient，Papp)。

2.5.3 wtdr-11在Caco-2單層細(xì)胞膜的雙向轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)前用37 ℃ HBSS液浸泡接種AP側(cè)孔30 min，吸去孔內(nèi)液體。AP→BL方向：在AP側(cè)加入含wtdr-11(20 μg/mL)的HBSS液0.5 mL，BL側(cè)加入空白HBSS液1.5 mL。置于37 ℃，以50 r/min振搖，并分別于60、90、120、180 min于下層采樣200 μL，并補(bǔ)充同容積空白HBSS液，將所取樣品按“2.4.1”項(xiàng)處理。BL→AP方向：將藥物加入BL側(cè)，AP側(cè)加入HBSS液，其余步驟同“AP→BL方向”實(shí)驗(yàn)操作。

3 結(jié)果

3.1 HPLC圖譜專屬性 結(jié)果表明wtdr-11的保留時(shí)間為4.5 min，空白HBSS液和內(nèi)源物質(zhì)在當(dāng)前色譜條件下無干擾，符合樣品分析方法的檢查要求。見圖2。

注：A.Caco細(xì)胞模型HBSS液；B.wtdr-11對照品；C.含有wtdr-11的Caco-2細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)液

3.2 HPLC方法學(xué)小結(jié) HPLC測定Caco-2細(xì)胞模型中wtdr-11標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=83 543.4x-173.28(r=0.997 3)，線性范圍為0.1～20 μg/mL，在此范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相對回收率均>90%，日內(nèi)和日間精密度RSD<5%，且在實(shí)驗(yàn)條件下37 ℃穩(wěn)定，符合樣品分析要求。

3.3 wtdr-11對Caco-2單細(xì)胞層的毒性作用 wtdr-11對Caco-2單細(xì)胞層的毒性結(jié)果如圖3所示，在0.1～20.0 μg/mL范圍內(nèi)時(shí)，細(xì)胞存活率在80%以上，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇此濃度范圍進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

圖3 wtdr-11對培養(yǎng)24 h的Caco-2 細(xì)胞活力的影響(n=5)

3.4 wtdr-11在Caco-2細(xì)胞中的攝取

3.4.1 不同時(shí)間對Caco-2細(xì)胞攝取wtdr-11的影響 藥物以時(shí)間依賴性方式積累，wtdr-11的吸收隨時(shí)間的增加攝取率緩慢降低。因此，選擇60 min作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的攝取時(shí)間。見圖4。

圖4 不同時(shí)間對Caco-2細(xì)胞攝取wtdr-11的影響(n=3)

3.4.2 不同濃度對Caco-2細(xì)胞攝取wtdr-11的影響 藥物的細(xì)胞攝取隨藥物濃度線性增加，在整個(gè)研究濃度范圍內(nèi)未觀察到飽和，表明藥物攝取可能是被動擴(kuò)散[15-16]。因此，選擇20 μg/mL作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的劑量濃度。見圖5。

圖5 不同濃度對Caco-2細(xì)胞攝取wtdr-11的影響(n=3)

3.4.3 不同pH值對Caco-2細(xì)胞攝取wtdr-11的影響 藥物的細(xì)胞攝取量隨pH值的增加逐漸增加。經(jīng)方差分析，pH值為5時(shí)，細(xì)胞對藥物的攝取與其他組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其他組組間比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，表明弱堿性環(huán)境有利于藥物的吸收。根據(jù)人體小腸pH值的環(huán)境，選擇pH值為7.4作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的條件。見圖6。

注：與其他組別比較，*P<0.05

3.4.4 不同溫度對Caco-2細(xì)胞攝取wtdr-11的影響 藥物的細(xì)胞攝取量隨溫度的升高略有增加，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，表明藥物攝取與溫度無關(guān)。因此選擇37 ℃作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的溫度條件。見圖7。

圖7 不同溫度對細(xì)胞攝取wtdr-11的影響(n=3)

3.4.5 不同P-gp抑制劑對Caco-2細(xì)胞攝取wtdr-11的影響 環(huán)孢菌素A和維拉帕米都是選擇性P-gp抑制劑。在維拉帕米和環(huán)孢素A存在的情況下，藥物的細(xì)胞攝取沒有顯著性差異，結(jié)果表明wtdr-11可能不是P-gp底物。見表1。

表1 環(huán)孢菌素A和維拉帕米對Caco-2細(xì)胞攝取wtdr-11的影響

3.5 wtdr-11在Caco-2細(xì)胞中的轉(zhuǎn)運(yùn)

3.5.1 Caco-2細(xì)胞模型單層膜完整性評價(jià) 使用ALP試劑盒測定Caco-2細(xì)胞兩側(cè)的ALP酶活性，AP側(cè)ALP活性比BL側(cè)ALP酶活性高約6.3倍。熒光黃透過量實(shí)驗(yàn)中，熒光黃的Papp為(6.365±0.81)×10-7cm/s，小于10-6cm/s，說明細(xì)胞膜完整性良好。

3.5.2 wtdr-11在Caco-2細(xì)胞模型中跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn) 藥物的雙向轉(zhuǎn)運(yùn)量都隨著時(shí)間的增加而增加。根據(jù)細(xì)胞模型Papp的計(jì)算公式，藥物從AP側(cè)到BL側(cè)的Papp值為58.4×10-6cm/s，從BL側(cè)到AP側(cè)的Papp值為82.8×10-6cm/s，推測藥物在小腸吸收良好[17]。隨著時(shí)間的延長，藥物總體轉(zhuǎn)運(yùn)隨時(shí)間增加，且BL側(cè)到AP側(cè)轉(zhuǎn)運(yùn)速度大于AP側(cè)到BL側(cè)。ER為1.42，表示轉(zhuǎn)運(yùn)有方向性，且小于1.5，主要屬于被動擴(kuò)散。見圖8。

注：與BL→AP 60 min組比較，*P<0.05；與AP→BL 60 min組比較，#P<0.05

4 討論

癌癥是嚴(yán)重威脅人類健康的復(fù)雜疾病，是世界科學(xué)領(lǐng)域的重要研究課題之一。作為一種新型抗腫瘤候選藥物，wtdr-11具有很強(qiáng)的抗腫瘤活性，但其口服生物利用度差(低于20%)阻礙了其臨床應(yīng)用。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)?zāi)軠?zhǔn)確地反映藥物給藥后的吸收過程，但很難從細(xì)胞或分子水平上研究藥物的吸收機(jī)制。Caco-2細(xì)胞模型具有細(xì)胞極性，緊密連接，與小腸上皮細(xì)胞非常相似，可以研究藥物從小腸的AP側(cè)到BL側(cè)和從BL側(cè)到AP側(cè)的轉(zhuǎn)運(yùn)特征，用來表達(dá)藥物的轉(zhuǎn)運(yùn)方式，建模后需經(jīng)過細(xì)胞單層完整性評價(jià)才能進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)研究。為驗(yàn)證Caco-2細(xì)胞單層的分化程度，對ALP活性進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，培養(yǎng)21 d的細(xì)胞模型AP側(cè)磷酸酶活性是BL側(cè)的6.3倍，表明細(xì)胞極性分化已經(jīng)形成。此外，本研究對細(xì)胞模型的完整性進(jìn)行了評價(jià)，實(shí)驗(yàn)中選用熒光黃作為滲透實(shí)驗(yàn)藥物測定了培養(yǎng)21 d的Caco-2細(xì)胞模型。從數(shù)據(jù)可知，熒光黃的Papp為6.37×10-7cm/s，小于10-6cm/s，說明此細(xì)胞完整性良好[18-20]，適合進(jìn)行藥物轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)以Caco-2細(xì)胞模型研究wtdr-11的吸收與轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制，在攝取試驗(yàn)中，攝取時(shí)間盡量選擇攝取速度大的時(shí)間段，因此選擇60 min作為攝取時(shí)間。細(xì)胞對藥物攝取量在2.5～20.0 μg/mL范圍內(nèi)隨著濃度增加而增加，并且在實(shí)驗(yàn)范圍并未有飽和現(xiàn)象，提示攝取方式很可能是被動擴(kuò)散，因此選取20 μg/mL為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的濃度。在溫度的影響因素中，攝取量無顯著影響，因此選擇37 ℃的人體溫度為實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在不同pH值影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，隨著pH值的升高，藥物的攝取量也逐漸增加，表明在堿性環(huán)境下可能有利于wtdr-11的細(xì)胞攝取。但考慮到人小腸實(shí)際pH值為6.8左右，因此實(shí)驗(yàn)選擇接近此pH值的pH 7.4作為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)條件。在P-gp抑制劑實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)抑制劑對細(xì)胞攝取藥物量并沒有顯著影響。

口服制劑的腸道吸收可能涉及多種轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制，包括被動擴(kuò)散、外排和攝取轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，以及細(xì)胞旁通路。研究表明，藥物Papp跨越Caco-2細(xì)胞單層與其在腸上皮細(xì)胞中的吸收有關(guān)。當(dāng)Papp>1×10-6時(shí)，表明藥物在腸上皮細(xì)胞中吸收良好；Papp值在1×10-7～1×10-6之間，為中度吸收。然而，Papp<1×10-7表示藥物在腸道中的吸收較差。在本實(shí)驗(yàn)中，藥物的雙向轉(zhuǎn)運(yùn)量均隨時(shí)間的增加而增加，Papp(AP→BL)為58.4×10-6cm/s，Papp(BL→AP)為82.8×10-6cm/s，均大于1×10-6，表明wtdr-11在腸道內(nèi)有著較好的吸收。通常，ER值大于2的藥物的轉(zhuǎn)運(yùn)特征被認(rèn)為是轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白介導(dǎo)的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)的指標(biāo)。wtdr-11在Caco-2細(xì)胞間雙向轉(zhuǎn)運(yùn)的ER值小于1.5，表明該藥物的主要轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制可能為被動轉(zhuǎn)運(yùn)，不涉及主動外排。因此，可以推測，wtdr-11的低口服生物利用度不是由其較差的腸道吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白P-gp的外排作用引起的。這可能與該藥物的半衰期有關(guān)，藥物在體內(nèi)消除過快，或在進(jìn)入體循環(huán)前被胃腸道代謝，使藥物絕對生物利用度也隨之降低。為進(jìn)一步闡明該生物堿在腸道處置過程，可以考慮采用體內(nèi)腸灌流法和體外外翻腸囊法[21]等模型進(jìn)一步探討。本研究觀察了細(xì)胞膜屏障功能對wtdr-11的影響，進(jìn)一步闡述藥物的腸道吸收機(jī)制，為抗癌候選藥物的藥理研究提供藥物代謝動力學(xué)數(shù)據(jù)支持。