基于AngⅡ/TLR4/NF-κB通路探討滋陰潛陽方改善自發性高血壓大鼠腎損害的機制

劉 陽，董昌武，徐 慧，程 斌，王奇林，廖岳闖

(安徽中醫藥大學，安徽 合肥 230012)

中國有超過2億人口患有高血壓病[1]，長期處于高血壓狀態會對患者心、腦、腎等靶器官的結構與功能造成嚴重損害[2]。早期腎損害若未得到有效控制，最終有可能導致腎功能衰竭。因此，治療高血壓病，控制血壓是當務之急，預防及改善腎損害是重中之重。近些年來，許多研究表明，炎癥反應對高血壓病的發生、發展進程有不可忽視的影響，并且與高血壓早期腎損害具有密切的聯系。因此，對于炎癥反應在高血壓病對靶器官的損害方面的機制研究成為熱點[3]。本課題組前期研究[4-5]表明，滋陰潛陽方可有效降低高血壓大鼠血壓并降低其腎組織中白細胞介素(interleukin,IL)-6、IL-8等炎癥因子水平，從而改善高血壓大鼠腎損害。但其具體的作用機制有待進一步探討，基于上述研究，本實驗將腎臟血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)/Toll樣受體4(toll-like receptor 4，TLR4)/核轉錄因子-κB(nuclear transcription factor-κB，NF-κB)信號通路作為高血壓腎損害炎癥反應的特異性指標，采用自發性高血壓(收縮壓>160 mmHg)大鼠模型[6]進行實驗研究，以滋陰潛陽方進行干預，并以依那普利為對照，觀察滋陰潛陽方對自發性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rat，SHR)腎臟保護的內在機制。

1 材料

1.1 實驗動物 12周齡雄性清潔級SHR 40只，體質量(230±20)g，購自維通利華實驗動物技術有限公司[動物生產許可證號：SCXK(京)2016-0011]，收縮壓為160～190 mmHg。室溫下飼養，相對濕度為55%～60%，換氣次數為每小時10～15次，晝夜明暗交替時間為12/12 h，飼料和墊料經高壓滅菌，飲水為純凈水，自由攝水納食。

1.2 實驗藥物 滋陰潛陽方：制何首烏、鉤藤(后下)各20 g，熟地黃、生地黃、川芎各15 g，石決明(先煎)、煅牡蠣(先煎)各30 g。以上中藥飲片，均購于安徽中醫藥大學第一附屬醫院中藥房。煎煮方法：將藥物以10倍量的水浸泡2 h，待藥物完全吸水，煮沸1 h，過濾，將藥渣再用8倍量水煮沸1 h，過濾，合并2次濾液，濾液置低溫恒溫反應浴濃縮至含生藥質量濃度為2 g/mL，藥液裝瓶，4 ℃存儲；依那普利(江蘇制藥股份有限公司，國藥準字H32026567)購自安徽中醫藥大學第一附屬醫院西藥房，每片10 mg。

1.3 主要儀器和試劑 大鼠無創血壓測量系統(MS60)：上海玉研科學儀器有限公司；酶標檢測儀(EPoch)：美國伯滕儀器有限公司；低溫型研磨儀(kz-Ⅲ-FP)、RNA提取液(G3013)：武漢塞維爾生物科技有限公司；熒光定量PCR儀(CFX)：Bio-rad；對開門雙門冰箱(BCD-518WEC)：合肥美菱股份有限公司；-80 ℃冰箱：合肥Royalstar；電子天平(ME203E/02)：上海梅特勒-托利多儀器有限公司；AngⅡ、Ang(1-7)大鼠酶聯免疫試劑盒(E-EL-R1430c、E-EL-R1138c)：武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司。

2 方法

2.1 動物分組及干預措施 采用隨機數字表法將SHR分為模型組、依那普利組、滋陰潛陽方低劑量組、滋陰潛陽方高劑量組，每組10只。胃內給藥，根據實驗動物學中常用實驗動物與人的體表面積比例換算方法[7]，模型組每日給予0.9% NaCl溶液10 mL/kg灌胃，依那普利組每日給予依那普利1.05 mg/kg灌胃；滋陰潛陽方低、高劑量組每日分別給予5.85、23.4 g/kg(分別相當于成人臨床用藥等效劑量、4倍劑量)滋陰潛陽方湯劑灌胃，連續胃內給藥6周，每日2次。

2.2 實驗指標測定

2.2.1 血壓測量 將大鼠放置于無創血壓采集系統配套的鼠籠中，設定溫度為37 ℃，進行15～20 min預熱，使大鼠平靜且尾部血運充盈，采用套尾法，確定環形尾套無漏氣后，啟動加壓泵，在大鼠安靜且清醒狀態下，連續測量尾動脈收縮壓3次，最后取平均值作為結果。分別于給藥前、給藥2周、給藥4周以及給藥6周測量并記錄大鼠尾動脈收縮壓值。

2.2.2 腎組織病理形態學觀察 藥物干預6周，第42天血壓測量完畢后，禁食不禁水12 h，大鼠予以20%烏拉坦(120 mg/kg)腹腔注射麻醉，于大鼠腹主動脈取血，將4 mL血液標本離心(3 000 r/min)10 min，收集上層清液，置于-80 ℃冰箱凍存待測。取大鼠左腎，用0.9% NaCl清洗并去除結締組織，用濾紙拭干水分，分為兩部分，一部分腎組織放入脫酶EP管中，于-80 ℃冰箱冷凍保存，用于檢測大鼠腎組織TLR4、NF-κB p65 mRNA含量，另一部分腎組織采用4%多聚甲醛固定液固定，經過24 h后，進行蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色。

2.2.3 大鼠血清AngⅡ、Ang(1-7)含量測定 采用ELISA法檢測SHR血清中AngⅡ和Ang(1-7)的含量。按照試劑盒說明書進行檢測，嚴格遵守操作步驟，使用酶標儀測得各孔在450 nm波長下的光密度(optical density,OD)值，然后根據標準品的濃度以及OD值作出標準曲線，最后再利用該標準曲線計算各組SHR血清AngⅡ、Ang(1-7)的含量。

2.2.4 RT-qPCR法檢測大鼠腎組織TLR4、NF-κB p65 mRNA表達水平 模型組及各藥物干預組分別取腎臟組織100 mg加入到勻漿管中，研磨至無團塊，按照實驗說明書進行總RNA提取，然后進行PCR反應。反應條件：預變性，95 ℃ 10 min；變性，95 ℃ 15 s；退火，60 ℃ 30 s，一共經過40個循環。以GAPDH為內參基因，采用2-ΔΔCT法計算出各組大鼠腎臟TLR4、NF-κB-p65 mRNA表達水平。引物序列見表1。

表1 引物序列

3 結果

3.1 各組SHR治療前后尾部收縮壓比較 藥物干預前，模型組及各藥物干預組大鼠的血壓值比較，差異均無統計學意義(P>0.05)；模型組收縮壓隨著周齡增長而升高；給藥2周后，與模型組比較，依那普利組與滋陰潛陽方高劑量組大鼠血壓有不同程度的降低，依那普利組血壓降低更明顯(P<0.05)；自給藥4周后起，與模型組比較，依那普利組，滋陰潛陽方高、低劑量組血壓均顯著降低(P<0.05)；組間比較發現，依那普利組較其他治療組降壓作用更明顯，滋陰潛陽方高劑量組降壓作用優于滋陰潛陽方低劑量組(P<0.05)。見表2。

表2 各組SHR治療前后尾部收縮壓比較

3.2 各組SHR血清AngⅡ、Ang(1-7)含量比較 與模型組比較，各治療組大鼠血清AngⅡ含量都呈現出不同程度的降低，血清Ang(1-7)水平都有不同程度的升高(P<0.05)；其中依那普利組血清AngⅡ含量的降低、Ang(1-7)含量的升高較其他兩組更為顯著(P<0.05)，滋陰潛陽方高劑量組血清AngⅡ含量的降低、Ang(1-7)含量的升高較滋陰潛陽方低劑量組更為顯著(P<0.05)。見圖1。

注：與模型組比較，*P<0.05；與依那普利組比較，#P<0.05；與滋陰潛陽方高劑量組比較，△P<0.05

3.3 各組大鼠腎組織形態學觀察 模型組大鼠腎組織結構重度異常，部分腎小球周圍可見大量炎癥細胞浸潤(黑色箭頭所示)，腎小管刷狀緣脫落(黃色箭頭所示)。滋陰潛陽方低劑量組大鼠腎組織結構明顯紊亂，腎小球周圍炎癥細胞數量較模型組減少(黑色箭頭所示)，部分腎小管刷狀緣脫落(黃色箭頭所示)。滋陰潛陽方高劑量組與低劑量組相比，損傷程度有很大改善，腎小球周圍炎癥細胞數量明顯減少(黑色箭頭所示)；依那普利組與其他3組相比，腎組織結構更為完整，腎間質僅可見少量炎癥細胞浸潤。見圖2。

注：A.模型組；B.滋陰潛陽方低劑量組；C.滋陰潛陽方高劑量組；D.依那普利組

3.4 各組SHR腎臟組織TLR4、NF-κB p65 mRNA表達水平比較 與模型組比較，各治療組大鼠腎臟組織中TLR4、NF-κB p65 mRNA表達水平均顯著降低(P<0.05)。其中依那普利組TLR4、NF-κB p65 mRNA表達水平較其他兩組降低更為顯著(P<0.05)，滋陰潛陽方高劑量組TLR4、NF-κB p65 mRNA表達水平較滋陰潛陽方低劑量組降低更為顯著(P<0.05)。見表3。

表3 各組SHR腎組織TLR4、NF-κB p65mRNA表達水平比較

4 討論

高血壓腎損害可歸屬于中醫學“腰痛”“腎勞”等范疇，是高血壓病嚴重并發癥之一。據研究[8]報道，高血壓病的發生過程中多器官伴隨著低水平炎癥反應，而血壓過高又會加重炎癥反應，炎癥過程中釋放的炎癥因子可促進高血壓病的發展并對其靶器官造成損害。課題組前期通過臨床觀察發現，滋陰潛陽方能夠通過補腎陰、益精血、活血祛瘀通絡改善高血壓早期腎損害患者的腎功能[9]，方中鉤藤具有良好的降壓作用，石決明、牡蠣潛陽，熟地黃滋腎陰、生地黃清熱涼血養陰，川芎活血祛瘀通絡，諸藥合用，共奏潛陽降壓、活絡通瘀護腎之功。課題組前期實驗發現，滋陰潛陽方能夠對“兩腎一夾”高血壓大鼠早期腎損害起到保護作用[10]。本實驗采用穩定的SHR進行研究，盡可能避免因外界影響造成或加重大鼠炎癥水平。

高血壓腎損害與血液中AngⅡ表達增多具有密切關系[11-12]，AngⅡ是腎素-血管緊張素-醛固酮系統的主要效應物[13]，其作為一種強大的縮血管物質，可令局部血管張力增高，加重高血壓病進展，激發炎癥反應[14]，在高血壓腎損害的過程中亦起著不容小覷的作用[15-16]。TLR4是Toll樣受體參與慢性炎癥作用中被研究較多的受體之一，AngⅡ可直接與血管內皮細胞上的TLR4結合，當AngⅡ過度表達時，可激活TLR4所介導的信號通路，從而激活其下游NF-κB并使之磷酸化，激活多種炎癥因子，誘導炎癥反應的產生，TLR4通過上調其下游因子NF-κB的表達調控多種炎癥因子的釋放，在高血壓腎損害的發展中發揮著重要作用[17]。有研究[18]發現，可通過降低AngⅡ和TLR4、NF-κB p65的表達，抑制AngⅡ誘導的TLR4/NF-κB炎癥通路激活，從而減輕高血壓腎損害。這與本實驗中滋陰潛陽方能夠有效降低SHR血壓、血清AngⅡ水平以及大鼠腎臟TLR4、NF-κB p65 mRNA表達水平的結果基本一致。本實驗結果顯示，通過6周的干預，與模型組比較，各藥物干預組大鼠腎臟中TLR4 mRNA、NF-κB p65 mRNA表達水平明顯降低，其中滋陰潛陽方高劑量組比滋陰潛陽方低劑量組下降更為明顯(P<0.05)，表明滋陰潛陽方能夠以降低血清AngⅡ水平、抑制TLR4/NF-κB通路激活的方式減輕腎臟損害。另外，腎臟形態學觀察結果顯示，經過治療，滋陰潛陽方高劑量組、依那普利組大鼠腎臟結構較為清晰，與模型組相比，炎癥細胞較少，說明大鼠血壓升高的同時，對腎臟的損害開始加重，而滋陰潛陽方能夠有效減少和改善SHR腎臟炎癥浸潤。

Ang(1-7)是重要的血管抑炎因子，其主要由血管緊張素轉換酶2(angiotensin-coverting enzyme 2，ACE2)水解AngⅡ產生，Ang(1-7)在體內分布較廣，主要分布于血液及腎臟血管等處，能夠抗炎、舒張血管、穩定內皮細胞等[19-21]，進而起到降壓、保護心臟、延緩動脈粥樣硬化的作用，以減輕高血壓病對心、腦、腎等靶器官的損害等[22-24]。戴亞東等[25]發現，Ang(1-7)可以顯著降低SHR血壓水平，并能夠抑制內質網應激以保護心肌細胞，延緩左心室肥厚，表明利用ACE2/Ang1-7拮抗AngⅡ是一種有效且重要的降壓方式。本研究結果顯示，未施加干預因素的模型組大鼠，其血壓隨著時間的增加而增長；藥物干預組從第4周開始，血壓得到有效的控制，并呈現不同程度的降低，再次證明滋陰潛陽方有較好的降壓效果。與模型組相比，滋陰潛陽方高、低劑量組大鼠血清AngⅡ水平降低，血清Ang(1-7)水平升高，且滋陰潛陽方高劑量組降壓效果優于滋陰潛陽方低劑量組(P<0.05)，即存在量效相關性。結果表明滋陰潛陽方可以通過降低SHR血清AngⅡ水平擴張血管而降壓，以及提高血管抑炎因子Ang(1-7)水平減輕血管炎癥、舒張血管而降壓，進而緩解高血壓腎損害進展。由于Ang(1-7)主要是由ACE2水解AngⅡ產生，推測滋陰潛陽方可能有促進ACE2水解AngⅡ為Ang(1-7)的作用，并同時具有直接影響AngⅡ水平的作用，其內在作用機制有待后續實驗研究。

綜上所述，滋陰潛陽方能夠在減輕SHR腎臟組織損害的同時改善其腎臟組織形態，起到延緩高血壓腎損害的作用，其機制可能與調控AngⅡ/TLR4/NF-κB信號通路，降低炎癥因子過度表達有關。本研究在動物周齡、藥物治療時長的選擇等方面需要優化，遠期療效與相關因素的關系仍需進一步探討。