獨活-桑寄生藥對治療類風濕性關節炎的網絡藥理學分析

陳若冰，魏秀娟，莊曉純，黃國彬,4，陳小蕓,4，陳一村

（1．汕頭大學醫學院第一附屬醫院靜脈用藥調配中心，廣東 汕頭 515041；2．汕頭大學醫學院藥理學教研室，廣東 汕頭 515041；3．潮汕職業技術學院，廣東 普寧 515300；4．廣東維安檢測科技有限公司，廣東 普寧 515300）

類風濕性關節炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種慢性炎癥性自身免疫性疾病，表現為關節滑膜炎、關節軟骨破壞、關節功能障礙等[1]。中醫稱為“痹癥”、“頑痹”等[2]。癥狀為關節的疼痛、腫脹、僵硬，甚者伴有心血管、肺、骨骼等并發癥[3]。由于發病機制尚不明確，目前尚未有能夠完全治愈的藥物。獨活寄生湯由獨活、桑寄生、杜仲、牛膝、細辛、秦艽、茯苓、川芎、肉桂、防風、人參、甘草、當歸、干地黃、芍藥多味中藥組成[4]。臨床常用于治療類風濕性關節炎等疾病[5]。獨活、桑寄生為獨活寄生湯的君藥藥對，是本復方制劑的重要組成部分。本研究利用網絡藥理學方法，對獨活-桑寄生藥對進行分析，探討這一藥對的藥效物質、作用靶點和相關通路，預測其作用機制。

1 材料與方法

1.1 查找獨活、桑寄生的有效成分和靶點

在TCMSP數據庫（https://tcmsp-e.com/）查找獨活、桑寄生兩味中藥的成分和靶點。篩選條件：口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，藥物相似性（drug likenes，DL）≥0.18。通過UniProt數據庫（https://www.uniprot.org/），限定物種為“Homo Sapiens”，將得到的靶蛋白轉換成基因，刪除重復基因，得到獨活-桑寄生藥對的靶點。導入Cytoscape3.7.2軟件，繪制獨活-桑寄生靶點網絡圖。

1.2 查找成分—疾病的交集靶點

在人類基因數據庫GeneCards（https://www.genecards.org/） 和 DrugBank數據庫 （https://go.drugbank.com/）中以“rheumatoid arthritis”為關鍵詞，物種為“Homo Sapiens”，檢索RA的疾病靶點。利用在線工具Venny2.1.0（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）繪制韋恩圖，得到RA與獨活-桑寄生的交集靶點。

1.3 構建蛋白-蛋白相互作用網絡圖

在 STRING 數 據庫 （https://string-db.org/）中，輸入交集靶點，物種選擇“Homo sapiens”，構建蛋白質-蛋白質相互作用（protein-protein interaction，PPI）網絡，等值置信度為0.7，其余參數為默認值。保存結果中的csv文件，導入Cytoscape 3.2.7軟件構建PPI網絡圖，根據Degree值的大小對數據進行可視化分析。

1.4 GO基因注釋和KEGG通路富集分析

登錄David數據庫（https://david.ncifcrf.gov/），物種選擇“Homo Sapiens”，對共同靶點進行GO和KEGG富集分析。將結果整理后，通過微生信平臺（http://www.bioinformatics.com.cn/）繪制柱形圖和氣泡圖進行可視化分析。

1.5 分子對接驗證成分與靶點的結合能力

將有效活性成分與核心靶點進行分子對接。在PubChem網站（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）上下載有效成分的3D結構（sdf格式），然后在RCSB蛋白數據庫（https://www.rcsb.org/）下載腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、蛋白激酶B（又稱Akt1激酶）、白介素-6（interleukin-6，IL-6）的結構（pdb格式），分別導入薛定諤軟件Maestro 11.1中，先對蛋白分子進行結構優化、去除水分子、能量最小化，然后以小分子配體所在的位置為對接位點，進行分子對接，得到對接分數。

2 結果

2.1 獨活-桑寄生藥的有效成分靶點網絡構建

通過檢索得到獨活-桑寄生有效活性成分11個（表1），獨活的有效成分靶點54個，桑寄生的有效成分靶點145個，刪除重復項后得到獨活-桑寄生靶點170個。圖1為有效成分與靶點的關系圖，共有179個節點，251條邊。根據Degree值設置節點的大小。Degree值排名前5的化合物有槲皮素、β-谷甾醇、O-乙酰二氫歐山芹酯、當歸酮和歐前胡素。其中，槲皮素（SJS1）在網絡中起著重要的作用，與146個靶點有關。成分DH9沒有對應的靶點，在網絡中未體現。

圖1 獨活-桑寄生成分靶點網絡圖

表1 獨活-桑寄生有效成分

2.2 查找疾病靶點和交集靶點

通過GeneCards數據庫，得到RA相關的靶基因5 017個，兩次截取相關性評分（relevance scores）在中位數以上（≥2.61）的靶基因，得到1 259個靶基因。在DrugBank數據庫中，查找到RA靶基因154個。合并去重后得到1 352個疾病靶基因。繪制韋恩圖，找出與有效成分的交集靶點89個，見圖2。

圖2 藥物—疾病靶點韋恩圖

2.3 PPI網絡的構建

將STRING數據庫上獲得的結果中的csv文件導入Cytoscape3.7.2，得到含85個節點和619條邊的網絡圖（圖3）。使用工具Network Analyzer進行分析，選擇Degree設置節點大小和顏色深淺。Degree值越大，節點越大，顏色越深。Degree值在中位數以上的靶點有40個，其中TNF、Akt1、IL-6、JUN、TP53、RELA、IL1B、EGFR、CASP3、MAPK1等靶點與其他靶點密切聯系，在PPI網絡中起著重要的作用。

圖3 獨活-桑寄生治療RA的共同靶點PPI網絡圖

2.4 交集靶點的GO和KEGG富集分析

GO富集分析共獲得生物過程（biological process）380項，主要是干擾RNA聚合酶Ⅱ啟動子、DNA模板轉錄的正調控、炎癥反應等生物過程；細胞組成（cell components）35項，涉及細胞核、細胞外間隙、細胞質等；分子功能（molecular function）68項，涉及蛋白質結合、相同蛋白質結合及酶結合等。每個類別取基因數排名前10的項進行作圖分析，見圖4。其中，蛋白質結合（protein binding）的基因數最多。KEGG分析中獲得97條通路。篩選出基因數排名前20的通路，繪制氣泡圖（圖5）。結果顯示，腫瘤通路（pathways in cancer）、乙型肝炎通路（Hepatitis B）、TNF信號通路（TNF signaling pathway）富集的基因數最多。這些通路中與炎癥相關的通路見表2。

圖4 交集靶點GO富集分析

圖5 交集靶點的KEGG通路氣泡圖

表2 炎癥相關的信號通路及涉及的靶點數

2.5 分子對接

對接分數為實驗解離/抑制常數的負對數，其絕對值大于5表示化合物和靶點有較好的結合能力[6]。表3為獨活-桑寄生藥對有效成分與核心靶點的分子對接結果。其中當歸醇D與TNF-α，異歐前胡素與Akt1，槲皮素與IL-6的分子對接分數絕對值較高。

表3 有效成分與核心靶點的分子對接結果

3 討論

獨活-桑寄生藥對是獨活寄生湯的君藥成分，在該復方制劑中占核心地位。獨活具有祛風勝濕止痛的功效。研究表明，獨活的藥理作用有抗炎、抗風濕、抗氧化和抗腫瘤[7-8]。桑寄生能補肝腎、強筋骨、祛風濕、安胎元，具有抗腫瘤、抗炎等多種藥理作用[9]。

本研究運用網絡藥理學，先找到獨活-桑寄生藥對與RA的共同靶點，然后構建PPI網絡，篩選出核心的靶點，其中腫瘤壞死因子TNF是關鍵的核心靶點。TNF在體內有α和β兩種結構，其中TNF-α發揮主要的作用。TNF-α與其受體TNFR1結合后激活TNF信號傳導通路，調控Caspase家族介導的細胞凋亡、NF-κB和JNK蛋白激酶的活化，引起炎癥反應[10-11]。Akt在體內起調控細胞存活和凋亡的作用，包括Akt1、Akt2和Akt3，其中Akt1是PI3K/Akt通路的重要組成。在外界細菌、病毒等炎癥因子刺激下，Akt蛋白被PI3K磷酸化激活，磷酸化Akt蛋白參與NF-κB、mTOR和JNK等炎癥信號通路的激活[12-13]。IL-6是體內重要的炎癥細胞因子，可促進細胞的增值與分化，IL-6還能促進激活STAT3信號通路，促使STAT3持續磷酸化，進一步抑制細胞凋亡和促進細胞增值。IL-6/STAT3信號通路可介導TNF-α、IL-1β等多種炎癥因子的產生，引起一系列炎癥反應[14]。獨活-桑寄生對靶蛋白的調節作用，間接影響各種炎癥信號通路，從而發揮抗炎作用。

類風濕性關節炎是一種復雜的慢性病，尚未有能夠完全治愈的藥物。目前的治療藥物以非甾體抗炎藥為主，然而治標不治本，副作用較大，部分患者不能耐受藥物，病情不能得到有效控制。近年來也出現了各種抗風濕藥、生物制劑和合成靶向藥物[15]，但是價格非常昂貴。從中醫的角度入手，挖掘中藥的寶庫。其中，獨活寄生湯治療類風濕性關節炎的療效顯著，得到很多臨床的證實。本研究通過網絡藥理學，找到獨活-桑寄生藥對的治療靶點和相關通路，為其治療作用提供理論的基礎。同時，還需要通過試驗的手段來驗證這些理論，為中藥復方制劑的療效提供有力的科學依據。