電子垃圾拆解區(qū)兒童尿液中6-羥基硫酸褪黑素水平的檢測分析

羅 瓊，霍 霞，陳梓涵，楊江夏，黃 宇，徐錫金，3

（1．汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院環(huán)境醫(yī)學(xué)與發(fā)育毒理學(xué)實驗室，廣東 汕頭 515041；2．暨南大學(xué)環(huán)境學(xué)院，廣東 廣州 510632；3．汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院細胞生物學(xué)與遺傳學(xué)教研室，廣東 汕頭 515041）

褪黑激素是由松果體合成并有晝夜節(jié)律性分泌的一種具有調(diào)節(jié)生物節(jié)律、促進睡眠、調(diào)節(jié)免疫活性、調(diào)節(jié)能量代謝和抗腫瘤能力的神經(jīng)內(nèi)分泌激素。褪黑激素由色氨酸轉(zhuǎn)化為5-羥色胺后，在5-羥色胺-N-乙酰轉(zhuǎn)移酶和羥基吲哚-O-甲基轉(zhuǎn)移酶的催化作用下合成[1-2]，經(jīng)肝細胞色素P450酶的作用轉(zhuǎn)化為6-羥基褪黑素，再與硫酸鹽結(jié)合形成6-羥基硫酸褪黑素（6-sulfatoxymelatonin，aMT6s），其中70%～80%的aMT6s隨尿液排出體外。晨尿中aMT6s濃度反映了夜間褪黑激素的最高水平[3]。研究表明，錳、鐵、銅等金屬在機體的累積會損傷神經(jīng)系統(tǒng)，通過使神經(jīng)元鈣離子穩(wěn)態(tài)失調(diào)、DNA修復(fù)受損和線粒體功能障礙等機制增加神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病風(fēng)險[4]。同時，重金屬可干擾多巴胺代謝、皮質(zhì)醇釋放等過程，從而擾亂機體的內(nèi)分泌系統(tǒng)[5]；此外，重金素暴露亦可引起免疫細胞及炎癥標志物水平的改變，對免疫系統(tǒng)產(chǎn)生消極的影響[6]。兒童作為環(huán)境污染的易感人群，且身體的各個系統(tǒng)正處于逐步發(fā)育完善階段，比成年人更容易受到鉛等重金屬污染物的毒性影響[7]。因此，本研究通過分析電子垃圾拆解區(qū)兒童尿液中aMT6s和外周血血清中白介素-13的水平，探討環(huán)境污染物暴露對兒童神經(jīng)內(nèi)分泌免疫調(diào)節(jié)功能的影響。

1 資料與方法

1.1 研究對象

2016年11—12月，共招募213名3～7歲兒童，平均年齡為（4.57±0.86）歲，其中暴露組105名（男56名，女49名）來自汕頭市潮陽區(qū)貴嶼鎮(zhèn)（電子垃圾拆解區(qū)），參照組108名（男60名，女48名）來自汕頭市濠江區(qū)（非電子垃圾拆解區(qū)）。所有參與兒童均未補充褪黑激素，無激素類藥物應(yīng)用史及慢性病史。本研究經(jīng)汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院倫理委員會審查通過，所有參與研究的兒童家長均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑與儀器

人 ProcartaPlex Human Cytokines Panel（34plex）試劑盒（美國Thermo Fisher Scientific公司）；人尿液aMT6s競爭酶免疫試劑盒（德國IBL international公司）；Luminex 200多功能流式點陣儀（美國Luminex公司）；Infinite M200 Pro光柵型全波長酶標儀（瑞士Tecan公司）。

1.3 方法

1.3.1 樣本采集收集兒童晨尿（中段尿）15 mL，1 mL分裝后置-20℃冰箱保存。采集兒童早晨空腹肘靜脈血2 mL于真空無抗凝劑采血管中，置于冰盒中運送至實驗室，3 000 r/min離心15 min后分離血清，200 μL分裝后置-80℃冰箱保存。

1.3.2 尿液aMT6s檢測取尿樣于冰上解凍，1 500 r/min離心5 min，取10 μL上清液加500 μL分析緩沖液稀釋，渦旋混勻；取10 μL標準品、質(zhì)控品分別加500 μL分析緩沖液稀釋，渦旋混勻；分別取標準品、質(zhì)控品和樣本各50 μL加入96孔微量滴定板；每孔中分別加入50 μL酶結(jié)合物和褪黑素硫酸鹽抗血清；振蕩器上500 r/min避光孵育2 h；緩沖液清洗4次；分別加入100 μL TMB底物液；500 r/min振蕩器上避光繼續(xù)孵育30 min；加入100 μL TMB終止液，搖勻；450 nm波長檢測。并將所測得的aMT6s濃度值（單位為nmol/L）除以同一標本的尿肌酐濃度值（單位為mmol/L）來表示aMT6s的水平。

1.3.3 外周血血清白介素-13檢測將兒童外周血血清樣本送至杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司進行檢測，采用ProcartaPlex Human Cytokines Panel（34plex）試劑盒對兒童外周血血清白介素-13水平進行分析，在Luminex 200多功能流式點陣儀上進行檢測。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

使用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件進行分析。非正態(tài)分布的計量數(shù)據(jù)以M(Q1，Q3)表示，用Mann-WhitneyU檢驗進行組間比較；正態(tài)分布的計量數(shù)據(jù)以±s表示，用獨立樣本t檢驗進行組間比較。采用Spearman相關(guān)分析判斷兒童尿液aMT6s水平與血清白介素-13水平的關(guān)系。當(dāng)P＜0.05時認為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。采用GraphPad Prism 9軟件作圖。

2 結(jié)果

2.1 兩組兒童尿液aMT6s水平的分布特征及比較

兩組兒童尿液中aMT6s水平為非正態(tài)分布，暴露組兒童aMT6s水平為59.30（37.81，94.04)，參照組兒童aMT6s水平為32.63（15.97，60.38），暴露組兒童aMT6s水平顯著高于參照組（P＜0.01）；暴露組男童和女童aMT6s水平均高于參照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P值均＜0.05），見圖1。

圖1 參照組和暴露組兒童尿液中aMT6s水平的比較

2.2 兩組兒童外周血血清白介素-13水平的比較

兩組兒童血清白介素-13水平為正態(tài)分布，暴露組兒童血清白介素-13水平為（6.88±5.41）pg/mL，參照組兒童血清白介素-13水平為（3.61±1.58）pg/mL，暴露組高于參照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

2.3 兒童尿液aMT6s與外周血血清白介素-13水平的關(guān)系

Spearman相關(guān)分析結(jié)果表明，兒童尿液aMT6s水平與血清白介素-13水平呈正相關(guān)關(guān)系（r=0.326，P＜0.001）。

3 討論

褪黑激素除了具有調(diào)節(jié)生物節(jié)律、促進睡眠功能外，還參與調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，調(diào)節(jié)促炎和抗炎細胞因子的水平，如白介素-1β、腫瘤壞死因子-α、干擾素-γ和白介素-10等[8]，并影響Th1/Th2細胞向Th1方向極化[9-10]。臨床研究顯示，膿毒癥患者的尿aMT6s排泄量顯著高于健康成人，并且白介素-6、腫瘤壞死因子-α與aMT6s水平呈顯著正相關(guān)關(guān)系。提示在膿毒癥期間，免疫活性細胞可能通過產(chǎn)生更多的褪黑激素對機體產(chǎn)生保護作用[11]。另一項關(guān)于哮喘兒童的研究發(fā)現(xiàn)aMT6s水平升高與丙二醛、8-羥基-2′-脫氧鳥苷水平升高顯著相關(guān)，同時aMT6s水平升高與肺部彈性及肺部炎癥改善相關(guān)[12]。以上研究提示褪黑激素水平的改變與機體免疫功能及炎癥狀態(tài)有關(guān)，而尿aMT6s含量的檢測可反映疾病或環(huán)境污染物對機體內(nèi)源性褪黑激素分泌狀態(tài)的影響。

本研究顯示暴露組兒童尿液中aMT6s和血清白介素-13水平顯著高于參照組，這說明貴嶼鎮(zhèn)不規(guī)范的電子垃圾拆解方式所導(dǎo)致的環(huán)境污染物暴露可能會誘導(dǎo)內(nèi)源性褪黑激素和炎癥因子白介素-13水平發(fā)生變化。動物實驗研究發(fā)現(xiàn)鉛的毒性會損傷5-羥色胺能和多巴胺能系統(tǒng)并導(dǎo)致紋狀體、大腦皮層、背側(cè)海馬等部位中5-羥色胺或其代謝產(chǎn)物的增加[13]，提示重金屬暴露可能會影響內(nèi)源性褪黑激素的水平。與文獻[11-12]的研究結(jié)果相似，環(huán)境污染物暴露可能會誘導(dǎo)暴露組兒童體內(nèi)產(chǎn)生更多的褪黑激素，從而進行自我保護。我們前期針對同一人群的研究發(fā)現(xiàn)，貴嶼鎮(zhèn)（暴露組）兒童體內(nèi)血鉛水平均顯著高于濠江區(qū)（參照組），且暴露組兒童體內(nèi)去甲腎上腺素濃度及脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2、白介素-6等炎性介質(zhì)的水平均發(fā)生了改變；表明重金屬污染物暴露影響兒童神經(jīng)內(nèi)分泌的免疫調(diào)節(jié)功能[14-15]，但其中的機制仍需要進一步研究。尿液aMT6s與外周血血清白介素-13水平的正相關(guān)關(guān)系則提示神經(jīng)內(nèi)分泌和免疫系統(tǒng)之間存在著明顯的關(guān)聯(lián)，機體可以通過分泌褪黑激素對免疫系統(tǒng)進行調(diào)節(jié)[16]。提示褪黑激素可能在環(huán)境污染物暴露對機體神經(jīng)內(nèi)分泌免疫系統(tǒng)的不良影響中起著重要的作用。

綜上所述，本研究表明電子垃圾拆解區(qū)環(huán)境污染物暴露對兒童神經(jīng)內(nèi)分泌免疫調(diào)節(jié)功能產(chǎn)生一定的影響，為進一步研究其發(fā)生機制提供了理論依據(jù)。