堿聯合超高壓預處理對筍殼酶解效率的影響

王延云，胡強，龔衛華，王燕，吳蔚

（1 樂山師范學院竹類病蟲防控與資源開發四川省重點實驗室，四川 樂山 614000；2 樂山師范學院生命科學學院，四川 樂山 614000；3 吉首大學杜仲綜合利用技術國家地方聯合工程實驗室，湖南 吉首 416000；4 樂山市產品質量監督檢驗所，四川 樂山 614000）

筍殼是竹筍加工或成竹后脫落下來的副產品，占竹筍量的50%以上。目前對筍殼的利用主要是作為垃圾丟棄于環境中，或提取其中的二元醇和黃酮類物質等活性物質，但后者的利用率不高，因此對筍殼的綜合利用，提高其附加值是目前研究的重點問題。前期的研究表明，筍殼是纖維素、半纖維素等多糖類物質含量豐富的木質纖維資源，來源廣且可再生，是理想的生物乙醇制備的原料。但是由于組分中木質素的存在，通過共價鍵和非共價鍵與纖維素和半纖維形成緊密的結構，缺乏吸附酶和被微生物降解的能力，使得纖維素難以高效酶解。因此想要高效利用纖維素，對木質纖維原料進行預處理，是解除木質素阻礙和提高酶解效率最關鍵的一步。

近年來，各種預處理方法得到了發展，包括生物、化學和物理方法，以及這些方法的組合。在生物預處理過程中，褐腐菌、白腐菌和軟腐菌等微生物被用來降解木質素和半纖維素，但降解率通常很低且時間較長。化學法主要是采用強酸和強堿預處理木質纖維原料，有效破壞其致密結構，增加酶與底物接觸機會，提高糖化效率，但是對設備有一定的腐蝕性。物理方法主要有蒸汽爆破、自水解、微波輔助等，物理手段通常與生物或者化學方法聯用，以達到更好破壞木質素纖維素的結構，降低纖維素結晶度的目的。

超高壓已經被廣泛應用于食品、化工、醫藥等領域，通過有效破壞微生物的細胞壁和甲基纖維素的結構，達到保鮮和殺菌的目的。近年來，超高壓技術被應用于木質纖維素的預處理，研究表明效果良好。Chen等發現超高壓預處理甘蔗渣能減小顆粒的尺寸，降低纖維素的結晶指數，增加可及的表面積，從而提高酶解甘蔗渣的效果。Jiang等采用NaOH聯合超高壓共同預處理竹子，研究發現在100MPa 的條件下，木質素的含量大幅地降低，獲得95.1%的理論乙醇得率。在超高壓預處理割草、玉米芯、梓鋸末和松木屑過程中，發現能顯著提高割草和玉米芯酶解還原糖的量，但是對梓鋸末和松木屑預處理的效果不明顯，這可能和木質纖維素的結構有關。而有些研究發現，單獨超高壓處理對木質素降解及含量的影響較小，對酶解的效果影響不明顯。因此，在本研究中探討單獨超高壓、聯合堿預處理及不同處理順序、單獨堿預處理四種不同預處理方法對筍殼酶解效率的影響，并首次報道了筍殼作為生物能源應用的材料，系統研究不同預處理條件對樣品的化學組成、顆粒大小、晶體結構、表面形貌以及酶解率的影響規律，以期為筍殼的高值化利用提供一個新的方向。

1 實驗材料和方法

1.1 原料及試劑

1.1.1 原料

慈竹筍殼采集于四川省樂山市安谷鎮。首先將筍殼用蒸餾水洗凈，自然陰干，粉碎，過40目篩，60℃過夜烘干，然后采用索式抽提器抽提10h（循環5～6 次/h），提取液為乙醇/水（7∶3，體積比），抽提物60℃過夜烘干后，備用。

1.1.2 試劑

纖維素酶Ctec2，諾維信（中國）生物技術有限公司；木糖，葡萄糖，德國DrEhrenstorfer GmbH公司；氫氧化鈉、乙醇、鹽酸、硫酸、乙酸及乙酸鈉均為分析純。

1.2 預處理

1.2.1 單獨超高壓處理（UHP）

準確稱取2g慈竹筍殼粉于包裝袋（尼龍+聚丙烯耐高溫復合材料，下同）中，加入20g/L NaOH溶液，料液比為1∶20，密封并采用超高壓處理，設置壓強為150～600MPa，溫度為室溫，時間為10min，超高壓處理結束后采用玻璃砂芯坩堝（G4）過濾，并用超純水多次洗滌至中性，收集固體樣品冷凍干燥后，備用。

1.2.2 單獨氫氧化鈉熱處理（AH）

準確稱取2g 慈竹筍殼粉于玻璃耐壓管中，加入20g/L NaOH溶液，料液比為1∶20，在高壓滅菌鍋中以121℃條件下水解2h。水解結束后，自然冷卻水解液至室溫，采用玻璃砂芯坩堝（G4）過濾，并用超純水多次洗滌至中性，收集固體樣品冷凍干燥后，備用。

1.2.3 超高壓后氫氧化鈉熱處理（UHP+AT）

準確稱取2g 慈竹筍殼于包裝袋中，加入20g/L NaOH 溶液，料液比為1∶20，密封并采用超高壓處理，設置壓強為150～600MPa，溫度為室溫，時間為10min，經不同超高壓處理后的慈竹筍殼在高壓滅菌鍋中121℃水解2h，水解結束后，自然冷卻水解液至室溫，采用玻璃砂芯坩堝（G4）過濾，并用超純水多次洗滌至中性，收集固體樣品冷凍干燥后，備用。

1.2.4 氫氧化鈉加熱后超高壓處理（AT+UHP）

準確稱取2g 慈竹筍殼于包裝袋中，加入20g/L NaOH 溶液，料液比為1∶20，高壓滅菌鍋中以121℃條件下水解2h。自然冷卻水解液至室溫后倒入包裝袋中，密封并采用超高壓處理，設置壓強為150～600MPa，溫度為室溫，時間為10min。超高壓處理結束后采用玻璃砂芯坩堝（G4）過濾，并用超純水多次洗滌至中性，收集固體樣品冷凍干燥后，備用。所有實驗平行3組。

1.3 酶水解

稱取200mg 經UHP、AH、UHP+AT、AT+UHP預處理樣品于10mL離心管中，加入37μL纖維素酶Ctec2（30 酶活單位/mL），用乙酸鈉-乙酸緩沖溶液補齊至整個酶解體系總體積為5mL，在酶解液中加入0.02%NaN，以防止細菌感染。將離心管放置在震蕩培養箱中，50℃、160r/min、酶解48h。取0.5mL 酶解液，沸水浴10min 以滅活酶活性，取出后冷卻至室溫，離心（6000r/min，5min），上清液經0.45μm 濾膜過濾，備用。用于測定還原糖的含量。

1.4 組分測定

木質纖維素的組分根據美國可再生能源實驗室（NREL）所推薦的方法測定。

1.5 表征方法

1.5.1 掃描電鏡（SEM）分析

用碳導電膠帶粘取1.2 節預處理后的凍干樣品（粉末），置于離子濺射儀（GVC-2000，北京格微科技有限公司）中，對樣品表面進行噴金處理，然后采用掃描電鏡（S-3000N，日本日立儀器有限公司），加速電壓為3.0kV 下，攝取不同放大倍數（10000倍和50000倍）的照片。

1.5.2 結晶度（CrI）分析

采用X射線衍射儀（D8 Advance X，德國布魯克公司）測定條件為輻射源Cu K；管壓40kV，管流40mA；2掃描范圍10°～90°，掃描速度6°/min，步長0.02°，樣品的結晶指數按照文獻[27]計算。

1.5.3 紅外光譜（FTIR）分析

采用傅里葉紅外光譜儀（Perkin Elmer 2000，美國鉑金埃爾默股份公司）KBr壓片法，樣品均勻分散于KBr 中，質量分數為1%。掃描波數范圍4000～400cm，掃描次數設為32次，分辨率4cm。

1.5.4 比表面積和孔結構測定

參考文獻[28]方法，采用低溫氮氣物理吸附儀（ASAP2020，美國麥克儀器有限公司），進樣前將樣品置于特制密封樣品盒中，以5mmHg/s 的抽氣速率60℃真空脫氣12h。儀器自動進樣后，得到樣品的N吸附脫附等溫線曲線和孔徑分布，用BET方程計算比表面積，用-Plot方法測定微孔體積。

1.6 還原糖的測定

采用二硝基水楊酸（DNS）法測定水解液中的還原糖。取樣品水解液用蒸餾水稀釋10 倍后取0.1mL于10mL比色管中，加入1.4mL DNS試劑并混合均勻，沸水浴5min 后迅速冷卻至室溫，加入6.5mL 蒸餾水搖勻。取200μL 于酶標板（Spectra-Max190，美國分子儀器公司）中，540nm測定光密度值（OD），以葡萄糖含量為橫坐標，光密度值為縱坐標繪制葡萄糖溶液標準曲線。根據葡萄糖標準曲線計算樣品中還原糖的產量。按式(1)計算筍殼中酶水解后的還原糖產率。

2 實驗結果與討論

2.1 預處理對筍殼化學組分的影響

未處理和不同預處理方法對慈竹筍殼化學組分的變化見表1。不同預處理的筍殼與未處理的原料相比，都表現出一定的脫木質素的效果。但是單獨超高壓脫木質素的效果不明顯，在不同壓力條件下，脫木質素的效果無明顯差異，高靜等單獨超高壓處理水稻秸稈后木質素的脫除率僅為10.9%，說明單獨超高壓對木質素脫除的影響比較小。而單獨AH、AT+UHP 和UHP+AT 三種預處理結果是木質素含量顯著減少，纖維素的含量則明顯增多。由表1可以看出，超高壓聯合堿加熱其纖維素的含量相較未處理樣品都顯著增加，而脫木質素效果AT+UHP 處理方式作用更明顯，這與后面的酶解效率有一定的相關性。對比分析不同壓力條件對木質纖維的影響發現，在壓強為600MPa 時，對木質素的脫除效果為最差，這可能是因為壓強過大反而影響木質素的溶解。

表1 預處理前后筍殼的化學組分分析

2.2 掃描電鏡分析

通過掃描電鏡可以觀察筍殼預處理前后表面微觀形態的變化，壓強設置為450MPa。由圖1所示，在1000倍和50000倍條件下，未處理和處理的筍殼樣品的表面發生了較大的改變。未處理的樣品結構緊密，微觀表面相對平滑，這種天然的結構是抵抗外界微生物或酶攻擊的有力屏障，可以阻止纖維素酶進入筍殼內部，降低酶的可及性。因此直接酶解效率很低，與后面筍殼原料酶水解效率低的結果一致。經過單獨超高壓處理（450MPa）處理，原料的完整形態被破壞，表面形成不規則的片狀，這說明在超高壓處理下，筍殼原料被強大的外力作用，在擠壓過程中結構受到破壞。單獨堿處理和堿聯合超高壓預處理后，筍殼樣品表面變得更松散、雜亂無序，呈現為極度粗糙和高度不規則的形態，結構嚴重被破壞，結構的改變主要是由大量木質素和部分半纖維素移除，以及預處理過程中纖維呈現不同程度的碎化，纖維之間的結合變得松弛引起的。與徐紹華等采用高溫熱水預處理后原料結構的改變較為相似，基本都呈現出結構松散，改善后續纖維素酶的可及性，提高酶解效率。

圖1 預處理前后筍殼樣品的掃描電鏡圖

2.3 結晶度分析

由圖2可以看出，未處理和預處理后的筍殼的X衍射譜圖比較相似，每個樣品在2=22.4°和18.2°各有一個主要峰和次要峰，與纖維素Ⅰ的特征衍射峰位置一致，說明預處理的樣品與未處理樣品的微晶結構未發生改變，都是纖維素Ⅰ型晶體結構。但從圖2可以發現，不同樣品的結晶指數發生了改變。未處理筍殼原料的結晶度指數為53.3%，而單獨超高壓處理后樣品的結晶度指數下降為51.2%，說明超高壓對破壞木質纖維素的微晶結構有一定的作用。與高靜等采用超高壓處理水稻秸稈的結果一致，在單獨超高壓處理下，水稻秸稈的結晶度指數由54.9%下降到51.2%。而單獨堿處理和堿聯合超高壓處理，筍殼樣品的結晶度指數都呈現不同程度升高，主要歸因于脫除筍殼中的無定形、非纖維素物質，如半纖維素和木質素。然而Mansikkam?ki等發現較高的堿濃度（7%～8%）加強了纖維素在堿溶液中的溶解性，從纖維素Ⅰ變為纖維素Ⅱ，結晶度降低。

圖2 預處理前后筍殼樣品晶體結構的變化

2.4 紅外光譜分析

紅外光譜分析用來檢測預處理前后竹筍殼結構的變化，由圖3所示，預處理后筍殼的特征峰強度有所變化，說明預處理后慈竹筍殼的結構發生了不同程度的改變。1734cm對應的是半纖維素乙酰基的伸縮振動，1600cm和1508cm處的吸收峰對應的是木質素芳環的特征峰，經堿加熱處理和堿與超高壓聯合處理后，與未處理樣品相比，該對應的三個峰減弱明顯，說明半纖維素和木質素在預處理中發生了降解，與后面成分分析的結果一致，而單獨超高壓處理峰形改變不明顯，說明超高壓對半纖維素木質素的降解效果不明顯。在纖維素的無定形區，β-1,4-糖苷鍵中C—O—C 伸縮振動在898cm處的有特征吸收峰，在所有的紅外譜圖中均有所體現，但譜線AH、UHP+AT、AT+UHP 中此峰的強度加強，說明經過經過單獨堿和堿聯合超高壓處理，樣品中的纖維素含量增加，與前面成分分析結果一致。

圖3 預處理前后筍殼樣品紅外光譜圖

2.5 比表面積和孔結構分析

由表2可以看出，未處理的樣品比表面積及孔體積都較小，其比表面積為0.821m2/g，孔體積為0.003cm3/g，說明慈竹筍殼結構本身致密，纖維素酶很難進入筍殼結構內部和纖維素形成有效的接觸，酶解效率低。另外，無論采用哪種預處理方法，預處理后樣品的比表面積及孔體積都變大，說明經過預處理后樣品的基質結構都被不同程度地破壞，引起比表面積以孔體積增加，纖維素酶和纖維素接觸反應機會增多，酶解效率增加。與未處理樣品相比，單獨NaOH熱處理后樣品的表面積和孔體積增大，比表面積為1.385m2/g，孔體積為0.006cm3/g，表明NaOH 預處理可以脫除部分的半纖維素，半纖維素的移除導致的樣品結構松動，樣品表面出現多孔且有碎片剝離出來（可從圖1中得到證實），酶進入內部的通道增多，比表面積和孔體積增加，酶解效率增加。UHP 預處理后，樣品的表面積和孔體積有所增大，分別為0.892m2/g 和0.004cm3/g，樣品表面孔數量增多、表面形貌變得不規則（圖1）。UHP+AT和AT+UHP預處理后，樣品比表面積和孔體積增加得更多，在AT+UHP條件下達到最大，比表面積為2.590m2/g，孔體積為0.010cm3/g，原因是木質素和部分半纖維素的脫出，木質素是細胞壁支撐結構，木質素的移除可以導致細胞壁坍塌，再加上部分半纖維素的移除，樣品表面孔數量增多、表面形貌變得不規則（圖1），因此經預處理后樣品的比表面積和孔體積增大。但AT+UHPE 預處理后，更多的纖維素暴露出來（圖1），酶解效率最高。

表2 預處理前后筍殼樣品比表面積和孔體積

2.6 酶水解效率

綜上所述，堿聯合超高壓預處理是一種對木質纖維素生物質的有效預處理方法。木質素含量、結晶度、比表面積、粒徑等影響酶解效率。表3 對比分析了未處理、單獨堿處理、單獨超高壓預處理、AT+UHP 和UHP+AT 預處理4 種方法對筍殼纖維素的酶解效率，并進一步對比分析了不同壓力條件對酶解效率的影響。在纖維素酶水解48h后，未處理樣品的酶解效率僅為13.51%，單獨堿處理和單獨超高壓預處理的樣品酶解效率均有所提高，分別為75.35%和49.13%～53.74%。單獨堿處理筍殼的酶解效率與Jiang 等單獨堿處理竹筍和兩年生竹樣品的結果相似，因為堿處理在一定程度上會降低木質素的含量，破壞筍殼原料的完整性，使結構松散、多孔，從而提高酶解效率。而單獨超高壓處理對木質素降解的效率比較低，與Yang 等的研究結果一致，但是超高壓會破壞木質纖維原料的完整結構，使其表面呈現出不規則碎片，降低纖維素的結晶性，都能在一定程度上增加纖維素酶對底物的可及性。

由表3 可以看出，無論是AT+UHP 還是UHP+AT預處理，都能很大程度上提高樣品的酶解效率，明顯高于單獨堿處理和單獨超高壓處理。AT+UHP在450MPa的條件下酶解效率高達97.89%，與Jiang等等聯合處理竹筍和兩年生竹子的酶解效率相似。而UHP+AT 預處理在450MPa 的條件下酶解效率為96.94%，說明堿和超高壓處理先后順序對酶解效率的影響不明顯。也進一步說明堿和超高壓聯合預處理是一種高效的預處理方法，顯著提高樣品的酶解效率。

不同壓力對酶解效率的影響可由表3看出，隨著壓強的增加，不同預處理樣品的酶解效率在不斷提高。但是當壓強超過450MPa 以后，進一步增加壓強反而會讓樣品的酶解效率呈現稍微下降，原因可能是當壓強達到450MPa 以后，木質纖維素結構的改變已經達到極限，隨后外界壓強的增加反而會稍微覆蓋前面已經形成的多孔結構，從而導致酶解效率有一定程度的下降。

表3 未處理和預處理后筍殼樣品酶解效率

3 結論

采用UHP、AH、UHP+AT 和AT+UHP 四種方法預處理后的樣品，與未處理的筍殼原料相比，酶解效率均有大幅度提高。采用UHP （150MPa、300MPa、450MPa 和600MPa）預處理樣品時，壓力的變化會影響樣品的酶解效率；UHP 預處理樣品的酶解效率（49.13%～53.74%）均低于AH 預處理樣品的酶解效率（75.35%）。UHP（450MPa）+AT 和AT+UHP（450MPa）預處理樣品，在50℃酶解48h 的條件下，其酶解效率分別可達96.94%和97.89%，說明堿加熱和超高壓處理順序對酶解效率影響不明顯，但堿聯合超高壓處理能顯著提高酶解效率，主要是因為在預處理過程中降低了樣品中的木質素和半纖維的含量，碎化纖維之間的連接，破壞樣品表面的微觀結構，使其結構松散、粗糙和多孔，提高纖維酶和底物的可及率，從而提高酶解效率。另外，堿聯合超高壓預處理樣品時，洗脫濾液可進一步通過調節pH、濃縮、沉淀等步驟，分離、利用堿溶性半纖維素、木質素和回收堿液。通過本研究，期望堿聯合超高壓預處理可以成為一種潛在的生物質預處理方法。