苦蕎芽苗菜黃酮超聲提取工藝

張恩華，王 亞，聶子涵，馬挺軍

(北京農學院 食品科學與工程學院，北京102206)

苦蕎(Fagopyrumtataricum(L.) Gaertn.)別名菠麥、烏麥、花蕎等，一年生草本植物。苦蕎是中國主要的雜糧作物之一，生長在高寒、貧瘠等地帶，主要分布在云南、貴州、四川、山西、甘肅、內蒙等地，在農業生產中占有重要地位。中國苦蕎種植面積達70萬公頃，產量多年居世界第一位。苦蕎中含有多種營養物質，包括淀粉、蛋白質、膳食纖維、維生素、微量元素等[1,2]。苦蕎還含有黃酮、酚類、多肽、糖醇、甾體等生物活性物質[3,4]，尤其是蘆丁等黃酮類物質的含量高，這賦予了苦蕎更高的經濟價值[5]。研究表明，長期食用苦蕎粉及苦蕎制品，有利于降低機體血糖、血脂水平[6]。

苦蕎口感較粗糙，含有蛋白酶抑制劑等抗營養因子，食用過多時易導致消化不良，這在一定程度上制約了苦蕎的消費。芽苗菜是各種谷類、豆類、樹類的種子經過發芽培養出來的可食用“芽菜”。芽苗菜的培育過程無需復雜操作，且培育時間較短，一般7～15 d即可成熟。利用苦蕎籽粒培育的苦蕎芽苗菜是一種綠色、營養的食品，具有高活性物質、高膳食纖維、低糖等特點[7]。

黃酮類物質的提取方法主要有超臨界流體提取法、超聲波提取法、微波提取法等。超聲波提取法是將超聲波作為介質，在短時間內增大物質分子運動速率，使溶劑的穿透力增強，可提升待提取物的溶出速度，且具有操作簡便、時間短、試劑使用量少等優點[8]。張國濤等[9]研究了蕎麥粉中黃酮類物質的超聲提取方法。宋越冬等[10]發現超聲提取的蕎麥葉黃酮含量較高，且具有良好的抗氧化活性。

目前，有關苦蕎芽苗菜黃酮提取工藝的研究報道較少。為了促進苦蕎芽苗菜中黃酮物質的開發利用，本研究以苦蕎麥芽苗菜為研究對象，采用超聲輔助提取法提取黃酮，在單因素試驗基礎上，對超聲時間、乙醇體積分數及液料比進行響應面優化，以期得到苦蕎芽苗菜黃酮的最佳提取條件。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

綠山谷苦蕎二號及芽苗培養盤，北京綠山谷芽菜有限責任公司；蘆丁標準品(純度≥99.0%)，美國Sigma公司；次氯酸鈉：國藥集團化學試劑有限公司；三氯化鋁、乙酸鉀、甲醇，北京化工廠，均為分析純。

電子分析天平，天津德安特傳感技術有限公司；超聲波清洗器，寧波新芝生物科技有限公司；臺式低速離心機，長沙易達儀器有限公司；恒溫恒濕培養箱，湖北黃石恒豐醫療器械有限公司；紫外-可見分光光度計，上海精科儀器有限公司；高速粉碎機，濰坊德爾粉體設備技術有限公司；真空冷凍干燥機，德國CHRIST凍干機有限公司；電熱恒溫鼓風干燥箱，天津市中環試驗電爐有限公司；立體高壓蒸汽滅菌器，上海申安醫療器械場；大氣等離子體放電設備，實驗室定制。

1.2 方 法

1.2.1 原料處理 選取籽粒飽滿、無霉變、大小均一的苦蕎種子，用蒸餾水淘洗干凈，然后用65 ℃熱水激活種子。種子經浸泡4 h后撈出，NaClO溶液消毒，用浸過水的透氣軟布包裹放在陰暗處進行催芽。把催好芽的種子均勻的碼放在芽苗培養盤中，并在苦蕎種子上蓋一張經等離子活化水噴濕的紙張，然后把苦蕎種子放置于背陰處進行催芽生長，培養得到苦蕎芽苗菜。將芽苗菜放入凍干機中冷凍24 h至干，磨粉，放入干燥皿中備用。

1.2.2 苦蕎芽苗菜中黃酮提取工藝 準確稱取0.500 g苦蕎芽苗粉，按照單因素乙醇濃度、液料比、超聲時間、超聲溫度及響應面試驗設計(表1，利用軟件 Design-Expert.V12.0.3.0中Box-Behnken方法)的條件提取黃酮，提取結束后，使用離心機在4 000 r/min 轉速下離心10 min。取上清液，得到黃酮粗提液，備用。

表1 單因素試驗條件和響應面因素及水平Tab.1 Single-factor test conditions and response surface factors and levels

1.2.3 黃酮含量測定 繪制標準曲線方程Y= 0.563X-0.067 6(R2=0.999 7)，其中X為苦蕎芽苗粉質量(mg)，Y為吸光度值。總黃酮的測定：取0.5 mL提取液于20 mL具塞試管中，加入0.1 mol/L三氯化鋁2 mL、1 mol/L乙酸鉀3 mL，再加入70%甲醇定容到10 mL刻度線，搖勻，靜置30 min后于420 nm處測定吸光度[11]。重復3次，計算平均值。

式中，Y1為總黃酮含量(mg/g)；X1為提取液中總黃酮質量(mg)；m為萌發苦蕎粉質量(g)；V取為提取液中移取體積；V定為提取液總體積。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 超聲時間對黃酮得率的影響 由圖1可知，當超聲時間從10 min延長到20 min時，黃酮得率顯著提高(P<0.05)，而當超聲時間繼續增加時，黃酮得率開始逐步下降。原因可能是當超聲時間小于10 min，苦蕎芽苗菜中的黃酮尚未提取完全；當超聲時間大于10 min之后，超聲處理使細胞壁破碎較完全，導致得率增加，但當超聲時間超過30 min，黃酮的分子結構被破壞，雜質析出，使黃酮得率下降[12]。

圖1 各因素對提取苦蕎芽苗菜黃酮得率的影響Fig.1 Effect of various factors on the yield of flavonoids from Tartary buckwheat sprouts

2.1.2 超聲溫度對黃酮得率的影響 由圖1可知，當超聲溫度從20 ℃上升到30 ℃時，黃酮得率顯著增加(P<0.05)。而當超聲溫度繼續增加至50 ℃時，黃酮得率逐漸降低(P>0.05)；超聲溫度增加至60 ℃時，黃酮得率顯著下降(P<0.05)。推測可能是因為超聲溫度高于50 ℃時，黃酮結構易被破壞，并且會使雜質加速溶出，從而降低黃酮得率[13]。

2.1.3 乙醇體積分數對黃酮得率的影響 黃酮類物質一般易溶于水、乙醇、甲醇等極性強的溶劑[14]；但難溶于或不溶于苯、氯仿等有機溶劑。乙醇具有毒性小、回收率高的優點，所以本試驗選用乙醇作為溶劑提取黃酮。由圖1可知，在乙醇體積分數80%時，黃酮得率達到最大值，為28.63%。乙醇體積分數增加至90%時，黃酮得率顯著下降(P<0.05)。這可能是因為乙醇濃度影響了細胞內外的濃度差，濃度越大越有利于黃酮浸出，但當乙醇濃度過高，會使苦蕎芽苗菜細胞中的脂溶性物質浸出，影響了黃酮浸出速度[15]。

2.1.4 液料比對黃酮得率的影響 由圖1可知，液料比在40 mL/g～80 mL/g內，隨液料比增大，黃酮得率顯著(P<0.05)增大，80 mL/g時達到最大值，為31.01%。當液料比增加至90 mL/g，黃酮得率下降(P>0.05)。溶液體積過小時，苦蕎芽苗粉與溶液接觸不充分，黃酮未被有效溶出，所以在一定的范圍內，隨著溶液體積變大，黃酮得率增加；但當溶液體積過高，單位體積物料接收到的超聲能量降低，使黃酮溶出速率降低，得率減小[16]。

2.2 響應面試驗結果

2.2.1 響應面試驗和顯著性檢驗結果 響應面試驗結果見表2。

表2 響應面試驗結果Tab.2 Response surface experiment results

利用Design-Expert.V12.0.3.0軟件得到各個因素與黃酮得率間的二次回歸方程：

黃酮得率=34.08-0.13A-0.10B+3.88C+0.083AB+0.36AC+0.97BC-2.00A2-0.88B2-7.55C2。

表3 回歸方程系數顯著性檢驗結果Tab.3 Results of significant test for regression coefficient

黃酮得率=34.08+3.88C+0.36AC+0.97BC-2.00A2-0.88B2-7.55C2。

2.2.2 響應面分析 利用軟件繪制各因素交互作用的響應面三維曲面圖和等高圖。能直觀反應各試驗因素的交互作用情況，響應面越平緩，表明該因素對黃酮得率影響越小，響應面越陡峭，說明該因素對黃酮得率影響越大[17,18]。超聲時間和液料比的響應面以及乙醇體積分數和液料比的響應面都較陡峭，但乙醇體積分數和超聲時間的響應面比較平緩，可以看出乙醇體積分數對黃酮得率的影響相對較小，而超聲時間和液料比對黃酮得率的影響顯著。黃酮得率對應各因素構成的一個三維空間在二維平面上的等高圖，能客觀反映各因素的交互作用及其對響應面的影響[19]。

2.2.3 最優苦蕎芽苗菜黃酮超聲提取工藝 通過響應面試驗，得出苦蕎芽苗菜黃酮的最佳超聲提取工藝條件為：超聲時間19.94 min、乙醇體積分數80.83 %、液料比82.63∶1，在此條件下預測的黃酮得率為34.59%。考慮到實際操作，將原有的模型條件修改為：超聲時間20 min、乙醇體積分數80%、液料比80∶1，在此條件下重復3次，黃酮得率為34.24%，與模型預測值基本相符。

3 結 論

本研究通過單因素試驗考察了影響苦蕎芽苗菜黃酮超聲提取得率的4個因素，并利用響應面試驗進一步分析了超聲時間、乙醇體積分數和液料比對黃酮得率的影響。初步明確了影響苦蕎芽苗菜黃酮得率的因素從大到小依次為液料比、超聲時間和乙醇體積分數。優化后的最佳提取工藝為超聲時間20 min、乙醇體積分數80%、液料比80∶1，在此條件下的黃酮得率為34.24%。