葉用萵苣ARF6基因克隆及高溫抽薹表達分析

張悅婷,杜 揚,李云峰,李振峰,韓瑩琰,劉超杰,郝敬虹

(農業應用新技術北京市重點實驗室/北京農學院 植物科學技術學院，北京102206)

葉用萵苣，可供食用的重要多葉類蔬菜之一[1]。質脆微甜，口感獨特，廣受人們喜愛。其適宜生長的環境溫度為15～20 ℃，高于30 ℃易于抽薹，致使食用價值降低，帶來減產乃至絕收的嚴重危害；在周年生產中生菜的高溫易抽薹問題非常嚴峻，目前急需解決。在眾多影響抽薹的因子中，植物激素如GA、IAA對抽薹開花起著重要作用[2]。其中被最早發現的生長素,參與調控植物生長發育中的各個過程[3]。

生長素的感知和信號轉導依賴于多種成分的協同作用，其中生長素應答基因受三種類型的轉錄調節因子控制，分別是生長素應答因子(ARFs)、Aux/IAAs以及Topless(TPLs)[4]。其中生長素/吲哚-3-乙酸(Aux/IAA)蛋白起著關鍵作用[5]。典型的ARF蛋白，其N端有一類似于B3 DNA的結合結構域，而在C端則有類似于Aux/IAA蛋白的結構域III區和 IV區；ARF蛋白可以通過其DNA結合域與生長素的應答基因啟動子區域即生長素應答元件(AuxREs)結合，包括Aux/IAAs亦可；ARF蛋白作為轉錄激活因子或是轉錄抑制因子是由它們中間區域的氨基酸組成所決定[6]。有研究表明：在擬南芥中，兩個相對應的生長素響應轉錄因子ARF6和ARF8協同調控雄蕊和雌蕊的成熟[7]。

就目前研究結果可知，ARF6蛋白是植物體內一種非常重要的轉錄因子，其參與多種激素的信號轉導途徑，對植物的生長發育有著重要的作用及意義。然而LsARF6基因與葉用萵苣抽薹性的相關關系尚不明確，此次試驗通過克隆LsARF6基因，對其進行生物信息學分析，同時運用實時熒光定量PCR技術(Quantitative Real-time PCR)分析葉用萵苣LsARF6基因在不同溫度處理下各個時期的相對表達量的情況，為進一步研究ARF6蛋白在葉用萵苣抽薹過程中的作用機制奠定良好的基礎。

1 材料及方法

1.1 育苗材料及處理方法

材料是農業應用新技術北京市重點實驗室編號保存的易抽薹葉用萵苣品種(GB-30)。200粒種子催芽，長出胚根，將芽播種于穴盤中。待幼苗長至4葉1心時定植于營養缽內，放入植物生長箱內生長。待緩苗2～3 d，對幼苗進行處理：相對濕度均為60%，光周期均為14 h/10 h。對照組：20 ℃(日)/13 ℃(夜)；高溫組：33 ℃(日)/25 ℃(夜)；于處理的第0、2、4、8、16、24天取植株的莖及成熟葉片，置于-80 ℃保存備用，3次重復。

1.2 總RNA提取和cDNA第一鏈的合成

使用總RNA快速提取試劑盒提取樣品總RNA；再使用cDNA第一鏈合成試劑盒進行反轉錄，所制cDNA于-20 ℃儲存，為后續LsARF6基因克隆做準備以及為實時熒光定量PCR做模板。

1.3 LsARF6基因克隆及實時熒光定量PCR

1.3.1LsARF6基因克隆 以轉錄組測序中的LsARF6序列為模板，使用Primer Premier 5軟件設計克隆引物(LsARF6-F和LsARF6-R)和qRT-PCR引物(LsARF6-qF和LsARF6-qR)，選用葉用萵苣18S作為內參基因(表1)。由生工生物工程股份有限公司提供引物。

表1 試驗所用引物Tab.1 Primers used in the study

克隆LsARF6基因，經PCR反應所得產物于4 ℃保存。

上述PCR產物通過瓊脂糖凝膠電泳，經紫外照射儀確定目的條帶位置，使用DNA凝膠回收試劑盒回收目的條帶，將回收獲得的目的條帶連接到pClone007 Versatile Simple Vector Kit克隆載體上，隨后導入到大腸桿菌DH5α感受態細胞中培養，最后將菌液送至北京博邁德基因技術有限公司進行測序。

1.3.2 實時熒光定量PCR 以對照組和高溫組各個時期的莖cDNA為模板，進行qRT-PCR。反應程序如下：95 ℃、30 s(預變性)，95 ℃、10 s(變性)，60 ℃、30 s(退火)，39次循環。采用2-ΔΔCt相對定量分析方法進行計算LsARF6基因的相對表達量，試驗數據的方差及顯著性分析處理采用SPSS 20.0軟件，表達量作圖使用Excel 2019。

2 結果與分析

2.1 葉用萵苣ARF6基因克隆

PCR擴增得到一條長2 436 bp的特異性條帶(圖1)，測序結果與轉錄組序列具有絕對一致性(100%)。

圖1 擴增的LsARF6基因Fig.1 AmplifiedLsARF6 gene

運用NCBI ORF finder分析知曉，此閱讀框編碼了811個氨基酸。

2.2 葉用萵苣LSARF6氨基酸序列及結構域分析

2.2.1 預測LsARF6氨基酸二級結構 運用NPS的SOPMA分析，該蛋白由無規則卷曲(含56.23%)、α螺旋(含25.15%)、延伸鏈(含15.04%)和β轉角(3.58%)組成。

2.2.2 LsARF6氨基酸序列比對 對葉用萵苣、洋薊及青蒿的LsARF6氨基酸進行序列比對(DNAMAN 9.0軟件)，結果表明ARF6蛋白與其他物種(洋薊及青蒿)的蛋白具有較高的相似性。其中LSARF6蛋白具有FSQQPPAQELI、RDLHDNEWKFRHIFRGQPKRHLLTTGWSVFVSAKRL VAGDSVLFIWNEKN、EFVIPLAK、RSVKVGWDESTAGERQPRVSLWEIEPLTTFPMYPSQFP LRLKRPWPPGLP等保守結構(圖2)。

圖2 LsARF6氨基酸序列比對分析Fig.2 Alignment and analysis of amino acid of LsARF6

2.2.3 LsARF6蛋白的保守結構分析 利用NCBI CD-search分析，該蛋白具有三種結構域(B3、Auxin_resp、AUX_IAA)(圖3)，他們分別是ARF家族蛋白與DNA結合的區域，ARF家族的保守結構域，ARF家族蛋白二聚體化的結合位點。這三個結構域為大部分的ARF家族蛋白所共有，由此推斷LsARF6蛋白可能具有ARF家族蛋白的功能。

圖3 LsARF6蛋白的保守結構域Fig.3 Conserved domain of LsARF6 protein

2.2.4 LsARF6氨基酸序列分析 利用ProtParam 軟件得知，該蛋白分子量為89 004.40，理論等電點為5.91；其含較多的亮氨酸(含10.5%)、絲氨酸(含10.4%)、而甘氨酸(含8.3%)；色氨酸(含1.8%)、酪氨酸(含1.7%)、半胱氨酸(含1.1%)含量較少，為不穩定蛋白(不穩定指數60.34)；親水性平均值為-0.357，預測為親水性蛋白。

2.2.5 分析LsARF6蛋白信號肽 運用SignalP 5.0所得數據分析，可知其不屬于分泌蛋白(不具信號肽，無跨膜結構)。

2.2.6 LsARF6蛋白質亞細胞定位 使用Psort軟件進行預測，預測結果表明其亞細胞結構主要定位于細胞核。由此可知LsARF6蛋白可能在細胞核內與生長素原初響應基因的啟動子上的(AuxREs)TGTCTC元件特異性結合，進而激活或抑制基因的表達，調控生長素的信號轉導。

2.2.7 LsARF6保守序列分析 利用MEME軟件對LsARF6的保守基因序列進行分析，發現該蛋白有位于B3、Auxin_resp、AUX_IAA保守結構域內的3個高度保守的基因序列(圖4)。

圖4 LsARF6的保守基因序列組成分析Fig.4 Sequence composition analysis of conserved genes LsARF6

2.2.8 LsARF6蛋白質三級結構的預測 進一步利用SWISS-MODEL推測LsARF6蛋白質三級結構，其匹配上多個ARF蛋白的模型，且含有ARF家族特有的保守結構，這一結果與NCBI CD-search分析的結果相吻合(圖5)。

圖5 LsARF6蛋白質三級結構預測Fig.5 The tertiary structure prediction of LsARF6

2.3 葉用萵苣ARF6蛋白的系統進化分析

將得到的LsARF6的氨基酸序列，在NCBI蛋白數據庫中進行比對，發現它與仙人掌、月季、向日葵等10種植物中ARF6蛋白具有較高的同源性。利用軟件MEGA 7.0構建系統進化樹。由圖6可以看出，這11條氨基酸序列明顯地分為三類，刺苞菜薊和向日葵等為第一類，兩者都是菊科作物，親緣關系最近；油菜等為第二類；蕪菁為第三類。

圖6 LsARF6蛋白的系統進化樹Fig.6 Phylogenetic analysis of LsARF6

2.4 葉用萵苣ARF6基因高溫處理后表達分析

由圖7可以看出，LsARF6基因在高溫組中的表達量均呈上升趨勢，并且其數值均高于常溫組。其中第8、16及24天的表達量差異明顯，均為極顯著差異。

綜合上述分析，得出結論：高溫促進易抽薹品種GB-30中LsARF6基因的表達，由此推測LsARF6基因可能在葉用萵苣抽薹過程中發揮功能。

*代表顯著，P<0.05;**代表極顯著，P<0.01* stands for significant, P<0.05; ** stands for extremely significant, P<0.01圖7 葉用萵苣GB-30在20/13 ℃、33/25 ℃下ARF6基因的相對表達量Fig.7 Relative expression analysis of ARF6 under 20/13 ℃,33/25 ℃ of lettuce GB-30

3 討 論

在ARF家族成員的研究中，Guilfoyle等[8]對擬南芥的ARF家族進行了鑒定，共鑒定出23個AtARFs，其中 AtARF6在氨基酸序列的中間區富含谷氨酰胺(Q)，絲氨酸(S)和亮氨酸(L)殘基，形成了一個激活結構域(AD)，能夠激活下游生長素響應基因的表達。這極有可能是SlARF6基因發揮抽薹作用的一種機制。相關研究表明：在莖及花器官中SlARF6表達水平最高,在果實中也有少量表達，此結果可以證明SlARF6基因參與果實的形成和發育過程，在一定程度上可以表明ARF家族基因在番茄發育過程中具有基因功能的多樣性[9]。而王飛燕等研究發現，葉片內ARF6幾乎不表達，在果實中有較高的表達量；試驗結果顯示番茄中的SLARF6、SLARF8-1經過2,4-D處理后表達量下調，其中經GA處理后SlARF6表達量也下調；這說明內源生長素信號在植物體內的傳導過程對花及幼果的生長發育極為重要，而外源激素(如赤霉素、生長素)在一定程度上能夠影響某些生長素相關基因的表達，進而對果實的發育進行誘導調節[10]。這與此次試驗結果有一定相似性，與高溫上調SlARF6基因表達促進抽薹是相一致的。Nagpal等研究發現：整朵花生長素水平在花的成熟過程中沒有發生變化，可推測生長素可能僅在特定的環境條件下或者是在花的局部器官或組織中調控花的成熟；ARF6和ARF8單突變體和倍半突變體(一個突變為純合，另一個突變為雜合)延緩了雄蕊發育，降低了植株的繁殖能力，由此可知ARF6和ARF8基因可能影響了花的成熟時間[11]。這同時也佐證了為什么SlARF6基因是在高溫條件下促進葉用萵苣抽薹。隨著各物種全基因組的研究開展，ARF家族的成員在擬南芥、煙草、甘草和小麥等植物中陸續得到鑒定[12-14]。這為研究ARF轉錄因子家族在植物生長發育過程中的功能和作用機制，以及如何參與生長素和其他植物激素的信號轉導途徑等研究奠定了良好的基礎。

此次試驗通過對易抽薹品種中LsARF6基因在不同溫度下表達量的分析發現，高溫組和對照組在處理過后的第2天出現差異,第8天開始及之后處理天數差異極顯著，LsARF6基因的表達水平受到高溫的促進而顯著上調，說明了LsARF6基因可能在葉用萵苣抽薹過程中發揮著重要的作用。后續可開展LsARF6調節葉用萵苣高溫抽薹的作用機制研究。