秋水仙堿處理對鼓槌石斛原球莖多糖含量的影響

包英華 ，蘇慧玲，陳永浩，馮藝飛，嚴基銀，張自斌

（1.韶關學院 英東生物與農業學院，廣東 韶關 512005； 2.廣西壯族自治區農業科學院 花卉研究所，廣西 南寧 530007）

鼓槌石斛（Dendrobiun chrysotoxumLindl.），又名金弓石斛、小爪黃草、粗黃草等，為蘭科石斛屬多年生附生草本植物，以新鮮或干燥莖入藥，是《中華人民共和國藥典》（2015年版）［1］收載的常用中藥材. 鼓槌石斛分布于我國云南、廣西、四川等省區［2］，主要含多糖、鼓槌菲、毛蘭素和毛蘭菲等活性成分，其中多糖是鼓槌石斛增強機體免疫功能和抗腫瘤的主要成分之一［3-6］.

由于鼓槌石斛市場需求量增大，野生資源已趨于瀕危，遠不能滿足市場需求，為此目前進行鼓槌石斛人工培育或栽培研究，但存在生長周期長，存活率低，生產成本高以及優質種苗培育、煉苗和移栽技術尚未成熟等瓶頸問題［7-9］，很難達到預期目標. 這些情況說明，提高鼓槌石斛多糖的途徑完全依靠野生或栽培藥材是行不通的.經研究發現，石斛原球莖具有和原植株同樣的物質代謝和形態發育潛能［10］，用原球莖合成多糖比細胞培養合成多糖產量更穩定，更容易實現規模化生產［11-13］.

目前，采用植物組織培養技術與誘導物相結合方法，提高珍稀瀕危藥用植物組織細胞代謝產物，已成為普遍關注的問題［14］. 尤其是秋水仙堿作為非生物誘導物，應用于多種藥用植物的多倍體培育，已成功獲得了形態（如莖稈、葉片、果實、種子、花朵等）加大和增多營養物質（如蛋白質、糖類、脂肪）的植物［15-17］. 控溫處理與秋水仙堿結合使用，更能提高秋水仙堿的誘導作用［18-19］.

本文采用秋水仙堿與控溫處理相結合的方法，對鼓槌石斛原球莖進行處理，探索秋水仙堿濃度、處理溫度、處理時間和原球莖培養時間對鼓槌石斛原球莖多糖含量的影響，以期為獲得高多糖含量的原球莖培育體系，以及為以原球莖為原料生產鼓槌石斛多糖提供依據.

1 材料與方法

鼓槌石斛采自于云南西雙版納，其種胚在1/2 MS基本培養基上培養60 d后，在無菌條件下，分別浸泡在不同濃度（0、0.1%、0.3%和0.5%）的秋水仙堿溶液中，分別在不同溫度（0、4、8、26 ℃）下進行不同時間（12、24 h）的處理，隨后把原球莖繼代培養在1/2 MS基本培養基上，在溫度為26±2 ℃，光照強度 1 500~2 000 Lx，光照時間14 h·d-1條件下進行培養，同時以不加秋水仙堿、26 ℃處理的為對照組（CK）.

每隔培養20 d后收取的鼓槌石斛原球莖除去培養基，以瓶為單位（3瓶為一組）稱量并記錄原球莖的鮮重；60 ℃烘干并稱重，采用《中華人民共和國藥典》（2015版）法測定鼓槌石斛原球莖多糖含量，實驗數據用SPSS Statistics 25.0軟件進行統計分析.

2 實驗結果

2.1 不同濃度秋水仙堿在不同溫度下處理12 h對鼓槌石斛原球莖多糖含量的影響

從表1可見，秋水仙堿濃度、處理溫度和原球莖培養時間均對鼓槌石斛原球莖多糖含量均產生影響，而且各處理因素之間差異顯著.

表1 秋水仙堿濃度、溫度和培養時間對鼓槌石斛原球莖多糖含量的影響（處理時間：12 h）

原球莖培養時間為20 d時，對照組和秋水仙堿濃度為0.1%，溫度均為8 ℃的原球莖多糖含量分別可達23.77%和35.60%；秋水仙堿濃度提高為0.3%（處理溫度為0 ℃）和0.5%（處理溫度為4 ℃）的多糖含量為19.01%和24.42%；分別高于其他溫度處理的多糖含量.

原球莖培養時間為40 d時，對照組（處理溫度為4 ℃）的多糖含量可達15.87%； 秋水仙堿濃度為0.1%和0.5%，處理溫度均為0 ℃時，多糖含量分別為18.70%和12.85%；秋水仙堿濃度為0.3%（處理溫度為8 ℃）的多糖含量為16.81%；分別高于其他溫度處理的多糖含量.

原球莖培養時間為60 d時，對照組和秋水仙堿濃度為0.1%，處理溫度均為8 ℃時，多糖含量分別可達20.77%和22.47%； 水仙堿濃度為0.3%和0.5%，處理溫度均為0 ℃時多糖含量分別為25.31%和12.40%；分別高于其他溫度處理的多糖含量.

原球莖培養時間為80 d時，對照組和秋水仙堿濃度為0.1%，處理溫度均為8 ℃時，多糖含量為22.04%和16.26%； 秋水仙堿濃度為0.3%，處理溫度均為8 ℃時的多糖含量為23.77%；秋水仙堿濃度為0.5%，處理溫度均為26 ℃時的多糖含量為14.79%；分別高于其他溫度處理的多糖含量.

分析結果表明，不同濃度秋水仙堿在不同溫度條件下處理12 h對提高鼓槌石斛原球莖多糖含量的最佳處理組合為秋水仙堿濃度為0.1%、處理溫度為8 ℃、原球莖培養時間為20 d，多糖含量可達35.60%.

2.2 不同濃度秋水仙堿在不同溫度下處理24 h對鼓槌石斛原球莖多糖含量的影響

從表2可見，秋水仙堿濃度、處理溫度和原球莖培養時間均對鼓槌石斛原球莖多糖含量產生影響，而且各處理因素之間差異顯著.

表2 秋水仙堿濃度、溫度和培養時間對鼓槌石斛原球莖多糖含量的影響（處理時間：24 h）

原球莖培養時間為20 d時，對照組在處理溫度為26 ℃和0 ℃時的多糖含量分別可達16.94%和17.06%，之間差異無顯著；秋水仙堿濃度提高為0.1%（處理溫度為26 ℃）、0.3%（處理溫度為4 ℃）和0.5%（處理溫度為8 ℃）時的多糖含量分別為36.62%、20.78%和16.01%；均高于其他溫度處理的多糖含量.

原球莖培養時間為40 d時，對照組在處理溫度為4℃時的多糖含量為15.92%；秋水仙堿濃度提高為0.1%（處理溫度為26 ℃）、0.3%（處理溫度為8 ℃）和0.5%（處理溫度為8 ℃）時的多糖含量分別為23.12%、18.22%和20.43%；均高于其他溫度處理的多糖含量.

原球莖培養時間為60 d時，對照組和秋水仙堿濃度為0.1%和0.3%，處理溫度均在在26 ℃時的原球莖多糖含量分別可達15.80%、30.63%、20.77%；秋水仙堿濃度為0.5%，處理溫度為8 ℃時的多糖含量為13.81%；均高于其他溫度處理的多糖含量.

原球莖培養時間為80 d時，對照組和秋水仙堿濃度為0.1%，處理溫度為26 ℃時的多糖含量分別為15.07%、24.45%；秋水仙堿濃度為0.3%和0.5%，處理溫度為8 ℃時的多糖含量分別可達21.09%和33.82%；均高于其他溫度處理的多糖含量.

分析結果表明，不同濃度秋水仙堿在不同溫度條件下處理24 h對提高鼓槌石斛原球莖多糖含量的最佳處理組合為秋水仙堿濃度為0.1%、處理溫度為26 ℃、原球莖培養時間為20 d，多糖含量可達36.62%.

2.3 不同條件下處理12 和24 h對鼓槌石斛原球莖多糖含量的影響主體間效應檢驗

從表3和表4可見，秋水仙堿濃度、處理溫度、培養時間等單因素，培養時間 * 處理溫度、培養時間 * 秋水仙堿濃度、處理溫度 * 秋水仙堿濃度等雙因素，以及培養時間 * 處理溫度 * 秋水仙堿濃度三因素均對鼓槌石斛原球莖多糖含量產生影響；對應的P值均為0.000，表明上述因素與鼓槌石斛原球莖多糖含量之間具有顯著性差異；效應檢驗的回歸系數r均為1.000，表明變量間具有很強的正相關性，影響效應均有統計學意義.

表3 不同濃度秋水仙堿在不同溫度下處理12 h對鼓槌石斛原球莖多糖含量影響的主體間效應檢驗

表4 不同濃度秋水仙堿在不同溫度下處理24 h對鼓槌石斛原球莖多糖含量影響的主體間效應檢驗

3 討論

鼓槌石斛原球莖經秋水仙堿處理之后，其多糖含量變化差異較大. 研究結果顯示，原球莖培養時間為20 d，秋水仙堿濃度為0.1%時，在8 ℃處理12 h的原球莖多糖含量可達35.60%、另在26 ℃處理24 h的原球莖多糖含量可達36.62%，這結果與滕建北等［20］從鼓槌石斛中提取的多糖含量30.65%相吻合，而且均高于相同條件下對照組的多糖含量23.77%和16.94%. 實驗結果說明，秋水仙堿和控溫處理相結合使用，對鼓槌石斛原球莖多糖積累會產生影響.這一方面可以培育出優質鼓槌石斛種苗提供條件；另一方面可以為以原球莖替代野生或栽培鼓槌石斛來生產鼓槌石斛多糖提供依據. 但高多糖含量的鼓槌石斛原球莖，其染色體數目或植物形態上是否產生變化、組培苗的移栽成活率如何等等方面需進一步深入研究.