氣相色譜分析氨基酸研究進展

祝偉霞， 張守杰， 郁 露， 師子豪， 楊 娜

（鄭州海關技術中心， 鄭州 450003）

氨基酸是生物功能的主要載體，已發(fā)現300多種氨基酸，是環(huán)境、食品、生物、生命活動中重要的物質，國內外學者從不同角度、不同方面、不同領域對氨基酸進行研究分析。 目前氨基酸測定方法包括專用儀器分析法、光譜法、色譜法、質譜法、電泳法和生物法[1]。 生物樣品基質復雜，氨基酸是蛋白質的構件分子，在進行測定前需要采用酸、堿和蛋白酶催化將蛋白質水解成α-氨基酸的混合物。 我國食品安全國家標準規(guī)定采用6 mol/LHCl溶液酸水解方法測定氨基酸，李梅等優(yōu)化了酸水解不同實驗條件[2]。 氨基酸屬于高活性、強極性、難揮發(fā)性的一類化合物，在氣相色譜分析時需要采用相應的衍生化技術改善其色譜行為。 本文主要介紹了采用氣相色譜技術測定氨基酸的研究進展。

1 衍生化方法進展

衍生化反應是采用氣相色譜測定游離氨基酸的主要步驟，氨基酸結構中存在氨基、羰基、羥基等多個極性基團，在中性溶液中以兩性離子存在，不易揮發(fā)性，進行氣相色譜分離時，極性基團與固定液產生氫鍵作用力，導致不出峰、峰形拖尾、靈敏度低等問題， 因此需將其衍生化成揮發(fā)性好且熱穩(wěn)定的衍生物后進行分析。 氨基酸衍生化可以在氨基和羧酸基團上進行，主要包括羥基硅烷化、羰基酯化和氨基?；苌夹g。

硅烷化衍生反應是通過硅烷基與羧基、氨基、羥基中活潑氫反應生成相應的硅酯衍生物， 常用的硅烷化反應試劑包括三甲基硅烷( TMS)、N-甲基-N-三甲硅基三氟乙酰胺( MSTFA)、N-O-雙(三甲硅基)三氟乙酰胺( BSTFA)等試劑。 硅烷化反應產物穩(wěn)定性強， 但硅烷化衍生物進行氣相色譜氫火焰離子化檢測器，長時間硅沉積易污染儀器，采用氣相色譜穩(wěn)定同位素質譜測定硅衍生物，降低燃燒爐的氧化效率，影響使用壽命。楊芹等采用MSTFA作為衍生化試劑，在全蝎中發(fā)現的16種游離氨基酸[3]。 酯化和酰化是兩種重要的氨基酸衍生化技術， 氨基酸的羧基和其它有機酸的羰基一樣， 在一定的條件下可以被醇酯化后，形成相應的酯類化合物。 當氨基酸的羧基變成甲酯、乙酯、丙酯、丁酯衍生物后，羧基的化學反應性能即被掩蔽，氨基的化學性能得到加強，更易于?；驘N基結合。 ?；磻窃诎被岬陌被c酰氯或酸酐在弱堿性溶液中發(fā)生作用， 酰基取代氨基酸結構中的活性氫。 因氨基酸結構中多個極性基團，聯(lián)合采用酯化和?；前被岱治鲎畛Ｓ玫难苌椒ǎ紫仍谙鄳拇己望}酸條件下酯化， 然后在非揮發(fā)性中間體蒸發(fā)后的?；Ｔ撨^程可產生N-酰基（乙?；?、三氟乙酰基、五氟丙基、七氟丁基等）的各種酯（即甲基、乙基、異丙基、仲丁基、戊基、異戊基等）化合物，表1列出常用酯?；椒ā?劉海珍等測定鰻魚肌肉組織16種氨基酸三氟酸異丙酯衍生物， 結果誤差在0.1‰～0.5‰之間[4]。許慶琴采用七氟丁酸酐和酸性正丁醇作為13種氨基酸的衍生化試劑， 氣相色譜氫火焰離子化檢測法測定了野生果汁中氨基酸含量，回收率在84.4%～96.0%之間[5]。李紅燕對比了氨基酸N-乙酰基正丙酯( NAP) 法和氨基酸N-三氟乙?；惐?TFAIP) 法測定17 種氨基酸衍生化效果,結果表明TFAIP測定偏差0.02‰～0.31‰，NAP0.04‰～0.67‰，證明TFAIP法結果更穩(wěn)定[6]。 孟慶國對比了影響19種氨基酸衍生化反應的酯化時間、酯化溫度、?；瘯r間和酰化溫度等條件， 結果表明?；磻獣r間越長，蛋氨酸衍生化產率越高，精氨酸和色氨酸產率下降，其它16種氨基酸溫度和時間影響小[7]。

表1 氨基酸分析不同的衍生化方法

2 儀器測定方法研究進展

根據氨基酸衍生物的物理化學性質和應用領域，氨基酸的測定主要采用電子捕獲檢測器（ECD）、氫火焰離子化檢測器(FID)、四極桿質譜技術(MS)和穩(wěn)定同位素比質譜技術(IRMS)。 高靈敏度的電子捕獲適用于增加鹵素的親電性衍生物。 FID對所有有機物產生信號響應， 信號強度與氨基酸衍生物的碳原子數成正比，在定量多種氨基酸含量方面應用廣泛，但氨基酸結構中氮、 氧雜原子影響FID信號響應，FID定量測定時，需要校正因子。許德成等采用FID法測定20種蛋白質氨基酸，測果結果與氨基酸分析儀進行對比，結果表明FID法分析魚松食品中氨基酸變異系數小于9.2%，氨基酸分析儀的變異系數小于8.2%[8]。

氣相色譜質譜法可以同時滿足定性和定量的需求， 張紅漫等采用氣相色譜一質譜法測定中藥沙苑子中的氨基酸， 測定沙苑子中氨基酸的總質量分數為4.23%[9]。楊瑞琴等采用氣相色譜-質譜聯(lián)用法分析手印殘留物中氨基酸的研究， 刑事科學技術手印顯現部分的發(fā)展提供幫助[10]。 氣相色譜同位素比質譜分析蛋白氨基酸的碳和氮元素， 可以溯源蛋白質的合成、降解和代謝，跟蹤碳氮元素轉化過程，對于生命科學和食品研究具有重要的意義。 鐘其頂等采用氣相色譜同位素質譜儀測定發(fā)酵液中游離氨基酸δ13C值，穩(wěn)定碳同位素豐度的精度誤差小于0.5‰[11]。何紅波等采用氣相色譜同位素質譜方法測定土壤氨基酸中氮同位素， 可有效區(qū)分土壤中原有的和利用外源氮素新合成的氨基化合物[12]。 孟靖等采用氣相色譜同位素比值質譜法測定枸杞氨基酸中氮同位素比，測定結果δ15N值精密度為0.13‰～0.52‰，未產生同位素餾分效應[13]。

3 存在的問題

氣相色譜測定氨基酸時存在的問題：首先，衍生化應時間長，需要多個步驟的溶劑轉移，衍生操作費時。 其次，評價結果準確性難，氨基酸的反應產率對照氨基酸標準品進行計算，無法計算準確蛋白質-氨基酸-衍生物的反應產率。最后，氣相色譜-質譜作為氨基酸的定性方法，應建立相應衍生物離子碎片、分子離子峰等NIST庫，實現準確定性。