在體記錄清醒小鼠丘腦網(wǎng)狀核場電位多通道電生理技術(shù)平臺的建立和驗證

姚云霞，張樹卓，蘇瑞斌，李明媛

（1.天津科技大學生物工程學院，天津市透明質(zhì)酸應(yīng)用研究企業(yè)重點實驗室，天津 300457；2.軍事科學院軍事醫(yī)學研究院毒物藥物研究所，抗毒藥物與毒理學國家重點實驗室，神經(jīng)精神藥理學北京市重點實驗室，北京 100850）

神經(jīng)元節(jié)律性活動，即振蕩，是大腦功能的基本特征，也是神經(jīng)元集合之間交流的重要手段[1]，其中γ振蕩是維持大腦中長距離通訊的神經(jīng)振蕩，頻率在30～80 Hz之間，參與多種認知過程，如選擇性注意[2]、感覺刺激特征的綁定[3]和記憶[4]等。γ振蕩主要由小清蛋白（parvalbumin，PV）中間神經(jīng)元通過突觸與錐體神經(jīng)元共同構(gòu)成神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)活動時產(chǎn)生。θ振蕩（4～7 Hz）與γ振蕩間存在相位耦合[5-6]。Klausberger等[7]研究表明，海馬PV中間神經(jīng)元的一些放電活動與θ振蕩高度相關(guān)。Yao等[8]研究表明，小鼠前額葉皮質(zhì)在活躍覺醒狀態(tài)下頻繁出現(xiàn)θ振蕩，并伴隨γ振蕩和高頻節(jié)律。此外，40 Hz和8 Hz嵌套的光遺傳刺激內(nèi)側(cè)前額葉PV中間神經(jīng)元可以正向調(diào)節(jié)社會行為[9]。神經(jīng)精神類疾病常伴隨有γ振蕩紊亂，如精神分裂癥[10]和自閉癥譜系障礙患者[11-12]中可見感覺誘發(fā)的γ功率降低；抑郁癥[13-14]和阿爾茨海默病患者[15-17]亦存在γ振蕩功率譜變化，前者γ振蕩功率降低，后者γ振蕩功率升高，提示γ振蕩可能是多種精神類疾病潛在的共同特征。探討不同腦區(qū)γ振蕩的變化在腦進行信息整合和執(zhí)行認知時發(fā)揮的作用，有助于其成為研究精神疾病病因和病理生理學的一個有價值的工具。

由于丘腦網(wǎng)狀核（thalamic reticular nucleus，TRN）是γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）能神經(jīng)元富集的核團，且富含GABA A型受體（GABA type A receptor，GABAAR）的表達，類似于“閘門”一樣，整合和調(diào)控丘腦皮質(zhì)之間的信息傳遞，似貝殼狀覆蓋于丘腦前外側(cè)部[18]，參與感覺處理、選擇性注意和睡眠[19-20]，對認知功能至關(guān)重要。目前，國內(nèi)外研究集中于大鼠的前額葉皮質(zhì)[21]和海馬腦區(qū)[22]，采用離體腦片[23]和麻醉急性在體[24]記錄等方法研究γ振蕩，但在清醒自由活動小鼠，特別是TRN腦區(qū)進行γ振蕩的研究未見報道。GABAAR拮抗劑荷包牡丹堿（bicuculline）能阻斷由電和化學刺激所誘導的γ振蕩[25]。因此，本研究在小鼠TRN腦區(qū)植入記錄電極，應(yīng)用在體多通道技術(shù)，建立清醒自由活動小鼠TRN腦區(qū)場電位γ和θ振蕩記錄平臺，用工具藥荷包牡丹堿對清醒自由活動小鼠TRN腦區(qū)γ和θ振蕩進行驗證。同時，利用T型鈣通道拮抗劑TTAA2〔（R）-2-（4-cyclopropylphenyl）-N-（1-（5-（2，2，2-trifluoroethoxy）pyridin-2-yl）ethyl）acetamide〕進一步探究參與維持γ和θ振蕩的機制，以期為揭示神經(jīng)精神疾病分子機制及新藥研發(fā)提供實驗手段。

1 材料與方法

1.1 動物、藥物、試劑和儀器

SPF級C57BL/6J雄性小鼠，20～22 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，實驗動物許可證號：SCXK（京）2019-0008，所有實驗小鼠均常規(guī)飼養(yǎng)于24℃環(huán)境中，12 h/12 h晝夜交替，自由飲水和進食。實驗動物的使用遵循軍事科學院軍事醫(yī)學研究院動物管理細則。

荷包牡丹堿（批號：S70107），美國Selleck公司；TTA-A2，上海陶素生化科技有限公司。戊巴比妥鈉（批號：140828），國藥集團化學試劑有限公司；0.9%生理鹽水（批號：2106223201），石家莊四藥集團有限公司；3%雙氧水（批號：200918），山東利爾康醫(yī)療科技股份有限公司；4%多聚甲醛（批號：BL539A），北京蘭杰柯科技有限公司；OTC包埋液（批號：oct 4583），德國Leica公司；紅霉素眼膏（批號：H44023088），廣州白云山藥業(yè)；生物膠（Kwik-sil），美國WPI公司；尼氏染色劑焦油紫（批號：33410），美國MedChem Express公司；多聚賴氨酸防脫片（批號：ZLI-9802），南通海倫生物醫(yī)學器材制造有限公司；中性樹脂封片劑（批號：abs9177），愛必信生物科技有限公司。微操縱器、多通道電生理記錄系統(tǒng)、Offline Sorter和NeuroExplore軟件，美國Plexon公司；體視解剖顯微鏡、顱骨鉆、立體定位儀和氣體麻醉機，瑞沃德生命科技公司；蠕動泵（型號：BT300-lF），保定蘭格恒流泵有限公司；冰凍切片機（型號：1950），德國Leica公司；熒光顯微鏡（型號：U-REF-T）和激光共聚焦顯微鏡（型號：FV3000），日本奧林巴斯公司；16通道電極，蘇州科斗公司；顱釘，瑞沃德生命科技公司；牙科水泥、小鼠血管夾及常規(guī)手術(shù)器械及用品若干。

1.2 小鼠記錄電極的植入

1%戊巴比妥鈉溶液60 mg·kg-1（ip）麻醉小鼠，5 min后夾小鼠后趾或尾部無疼痛反應(yīng)等現(xiàn)象即可進行開窗植入電極手術(shù)。剃除小鼠顱頂兩耳連線及兩眼連線間的毛發(fā)，暴露顱面皮膚，將小鼠固定于腦立體定位儀并使用碘伏進行消毒，眼部涂抹紅霉素眼膏，保護視力免受損傷。使用手術(shù)刀劃開顱骨頂部皮膚，用棉簽蘸取3%雙氧水清潔顱骨表面，凸顯骨縫及標志點。用小鼠血管夾分別夾取兩邊劃開的皮膚，上翻至旁邊使其形成一個凹槽便于儲存生理鹽水，防止骨面干燥損傷腦組織。為了保證定位準確，利用立體定位儀測量前囟（bregma）后囟（lambda）的水平高度以及左右腦水平高度，并進行調(diào)平。在小鼠顱骨表面植入2～3顆顱釘（直徑1.20 mm，長2.00 mm）用于電極固定、地線纏繞和信號記錄。根據(jù)第三版小鼠腦圖譜定位TRN（前囟前后0.70 mm，旁開左右1.42 mm，顱骨表面以下3.25～3.50 mm），記號筆標記，并以其為中心用顱骨鉆在周圍開一個長、寬各2.00 mm的窗口，暴露蛛網(wǎng)膜，自制小針頭（圖1）挑破硬腦膜后用精細鑷撕開窗口的硬腦膜。清潔目標腦區(qū)上皮質(zhì)表面后開始電極植入操作。首先將電極移至目標腦區(qū)皮質(zhì)表面上方后進行地線纏繞，而后通過自動微操縱器按50～100 μm·min-1的速度緩慢將電極植入大腦。待電極進入皮質(zhì)后，在電極周邊滴加生理鹽水溶解包裹在電極周圍的聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG），同時可保持暴露腦區(qū)濕潤。隨后利用生物膠覆蓋大腦暴露區(qū)域，靜待10～15 min后，用牙科水泥固定裸露的電極絲。待牙科水泥完全干后用生理鹽水繼續(xù)溶解剩余的包裹電極的PEG。最后吸干水分，利用牙科水泥對整個電極進行固定。術(shù)后，小鼠置飼養(yǎng)籠中進行單獨飼養(yǎng)，恢復(fù)期間，每日抓取小鼠進行撫觸2～3 min，并進行電極抓持模擬操作，使其適應(yīng)探頭（headstage）插拔動作。術(shù)后恢復(fù)1周，進行在體神經(jīng)信號數(shù)據(jù)采集。電極植入手術(shù)過程如圖1A和B，圖1C為在體電極記錄設(shè)置示意圖。

1.3 電生理信號的采集和處理

將術(shù)后小鼠提前1～3 d轉(zhuǎn)移至實驗室，并每天置記錄箱（錫紙包裹）30 min適應(yīng)環(huán)境。實驗前后輕撫小鼠5 min以減少應(yīng)激反應(yīng)。記錄前將小鼠置氣體麻醉機，用2%異氟烷誘導麻醉5 min，氣體流速0.5 L·min-1。麻醉后將探頭插到小鼠電極上，將其置活動箱自由活動。前期小鼠適應(yīng)環(huán)境，同時將不必要的儀器斷電，排除噪聲和50 Hz工頻的干擾。小鼠原始信號和場電位分別以40 kHz和1 kHz采樣頻率進行采樣，通過多級放大以及數(shù)模轉(zhuǎn)換將信號傳輸至計算機，用Plexon在體多通道記錄系統(tǒng)采集信號。待信號穩(wěn)定后記錄基線30 min，結(jié)束后ip給予荷包牡丹堿（2.5 mg·kg-1）（n=4）或 TTA-A2（1.0 mg·kg-1）（n=6），記錄信號30 min。

將采集到的信號用Offline Sorter進行預(yù)處理。該軟件一般用于處理Plexon記錄系統(tǒng)采集得到的原始數(shù)據(jù)，對原始數(shù)據(jù)進行1～100 Hz帶通濾波處理得到低頻的場電位，有交互式的可視化界面。再將其轉(zhuǎn)移至NeuroExplore進行進一步濾波。濾波器用于提取感興趣的振蕩信號。由于γ和θ振蕩均在低頻范圍內(nèi)，所以采取了低通Butterworth濾波器，階數(shù)為3，通過帶通濾波提取γ和θ振蕩。

1.4 記錄電極位置的驗證

1.4.1 灌流取腦

實驗結(jié)束后，蠕動泵一端連接置碎冰上4℃預(yù)冷的生理鹽水或4%多聚甲醛固定液，一端連接靜脈輸液針用于小鼠心臟灌流。1%戊巴比妥鈉溶液按60 mg·kg-1（ip）麻醉小鼠，將其仰臥位置于自制泡沫板上并固定四肢，U字形剪開皮膚、肌肉直至兩腋下，剪開肋骨、膈肌，止血鉗夾持劍突連帶胸腔向上翻固定，充分暴露心臟；小心去除心包，針尖輕輕插入左心室心尖，剪開右心耳后用生理鹽水快速置換出腦組織中的血液；待右心耳流出液體澄清透亮后更換4%多聚甲醛繼續(xù)灌流用于固定。在灌注多聚甲醛過程中可見小鼠四肢抽搐、尾巴擺動或翹起，灌流結(jié)束后小鼠內(nèi)臟鼓起、四肢肌肉僵硬，即可認為灌注成功。將小鼠處死后置冰上，剪開后頸皮膚，小心摳除顱骨表面的電極（勿破壞腦組織和電極軌跡），而后取出完整的腦組織置4%多聚甲醛中4℃冰箱保存。

1.4.2 冰凍切片

將上述腦組織置于30%蔗糖溶液中脫水，待沉底后置樣本托上，用OTC膠包埋后轉(zhuǎn)移至-20℃預(yù)冷30～60 min的冰凍切片機中，待包埋劑完全凝固后將完整的TRN部分切成厚30 μm冠狀切片，將腦片貼于黏附性載玻片上，自然風干后于-20℃冰箱保存。

1.4.3 尼氏染色

將切片從冰箱取出置室溫平衡10 min，1×PBS緩沖液漂洗3次，每次5 min；80%乙醇浸洗2次，每次30 s；0.1%焦油紫染液染色30 s，蒸餾水沖洗多余的染色劑；80%乙醇浸洗30 s、90%乙醇浸洗30 s、無水乙醇浸洗30 s梯度脫水；二甲苯透明2次，每次5 min；中性樹膠封片。待封片劑完全干后于顯微鏡下觀察電極軌跡，掃描拍片。

1.5 統(tǒng)計學分析

實驗結(jié)果數(shù)據(jù)以±s表示。應(yīng)用GraphPad Prism 8.0.2統(tǒng)計軟件，利用配對t檢驗比較同一通道給藥前后場電位功率譜密度。P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 荷包牡丹堿降低丘腦網(wǎng)狀核場電位 γ振蕩的功率譜

小鼠植入記錄電極恢復(fù)1周后記錄清醒自由活動小鼠TRN腦區(qū)場電位，經(jīng)濾波分析觀察到γ和θ振蕩（圖2A1和B1），隨后用GABAAR拮抗劑荷包牡丹堿進一步驗證（圖2A2和B2）。與基線相比，荷包牡丹堿（2.25 mg·kg-1）顯著減少γ振蕩（30～80 Hz和 35～45 Hz）的功率譜（圖3A 和 B，P＜0.05，P＜0.01），θ振蕩（4～7 Hz）功率譜未見明顯改變（圖3C）。

Fig.2 γ and θ oscillations recorded in TRN of freely moving mice.A：example of local field potential（LFP）（black line）and γ oscillation（blue line）recorded in the TRN before（A1）and after（A2）intraperitoneal injection of bicuculline（2.25 mg·kg-1）；B：example of LFP（black line）and θ oscillation（blue line）recorded in the TRN before（B1）and after（B2）intraperitoneal injection of bicuculline.

Fig.3 Bicuculline reduced γ oscillation power spectrum in TRN of freely moving mice.A1，B1 and C1：the power spectral density of γ oscillations（30-80 Hz and 35-45 Hz）and θ oscillation（4-7 Hz）in TRN before（baseline）and after intraperitoneal injection of bicuculline（2.25 mg·kg-1）for 30 min；A2，B2 and C2：the resluts of statistical analysis of A1，B1 and C1，respectively.±s，n=4.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with corresponding baseline.

2.2 TTA-A2降低丘腦網(wǎng)狀核場電位 γ和 θ振蕩的功率譜

與基線相比，TTA-A2（1.0 mg·kg-1）降低γ和θ振蕩的功率譜（P＜0.01，圖4和5），與文獻[26]報道一致；而且小鼠腦中低頻信號能量高，高頻信號能量低，亦符合小鼠體內(nèi)生物節(jié)律信息。

Fig.4 Effect of TTA-A2 on γ and θ oscillations in TRN of freely moving mice.A：example of LFP（black line）and γ oscillation（blue line）recorded in the TRN before（A1）and after（A2）intraperitoneal injection of T-type calcium channel antagonist（R）-2-（4-cyclopropylphenyl）-N-（1-（5-（2，2，2-trifluoroethoxy）pyridin-2-yl）ethyl）acetamide（TTA-A2）（1.0 mg·kg-1）；B：example of LFP（black line）and θ oscillation（blue line）recorded in the TRN before（B1）and after（B2）intraperitoneal injection of TTA-A2.

Fig.5 TTA-A2 reduced γ and θ oscillations power spectrum in TRN of freely moving mice.A1，B1 and C1：the power spectral density of the γ oscillations（30-80 Hz and 35-45 Hz）and θ oscillation（4-7 Hz）in TRN before（baseline）and after intraperitoneal injection of TTA-A2（1.0 mg·kg-1）for 30 min；A2，B2 and C2：the resluts of statistical analysis of A1，B1 and C1，respectively.±s，n=6.＊＊P＜0.01，compared with corresponding baseline.

2.3 記錄電極位置的確定

如圖6所示，電信號記錄實驗結(jié)束后，經(jīng)尼氏染色觀察腦組織尼氏體，TRN處可見清晰的電極軌跡，電極尖端處于目標腦區(qū)（紅星標記部位），證明電極埋植位置正確。

Fig.6 Location of recording electrodes in TRN of freely moving mice.A：post hoc histological image of electrode recording；B：TRN in the mouse brain map.The light red arrow indicates the position of TRN.The red pentacle arrow indicates the position of an electrode.

3 討論

TRN主要負責整合和調(diào)控丘腦皮質(zhì)之間的信息傳遞，其中存在大量的PV神經(jīng)元。γ振蕩主要是由PV神經(jīng)元介導產(chǎn)生的維持大腦中長距離通訊的神經(jīng)振蕩，具有參與編碼認知及注意力的重要功能。T型鈣通道參與維持γ振蕩活動。1992年，Pinauit等[27]建立了在體大鼠TRN γ振蕩的研究方法，該方法支持對清醒自由活動大鼠TRN進行神經(jīng)電生理研究。目前國內(nèi)外尚無關(guān)于小鼠TRN γ振蕩的相關(guān)報道。本研究采用多通道提高單次記錄的通量，在清醒小鼠自由活動狀態(tài)下記錄TRN神經(jīng)元場電位。由于神經(jīng)元的共振源于被動（時間依賴的低通濾波）和特定的主動（電壓依賴的高通濾波）膜特性的相互作用[28]，并且低通和高通濾波機制的適當組合可以產(chǎn)生諧振器（帶通濾波器）、陷波器（帶阻濾波器）和閾下振蕩器，使研究特定頻率范圍的節(jié)律性振蕩成為可能[29]。據(jù)報道，γ振蕩是GABAAR參與介導的[30]。本研究在清醒自由活動小鼠TRN記錄γ和θ振蕩場電位，通過對TRN的精準定位植入記錄電極，保證記錄數(shù)據(jù)的空間精度，同時對信號分析處理，濾波得到γ和θ振蕩，并利用工具藥荷包牡丹堿對其進行了驗證。研究結(jié)果表明，荷包牡丹堿（2.25 mg·kg-1）可顯著降低清醒自由活動小鼠TRN腦區(qū)γ振蕩功率譜，表明該清醒自由活動小鼠TRN腦區(qū)場電位記錄平臺建立成功。

TRN中的GABA能神經(jīng)元與丘腦多個背側(cè)核形成強大的抑制性連接，從而控制丘腦皮質(zhì)系統(tǒng)的注意、感覺加工和同步振蕩。文獻報道，在TRN腦區(qū)突觸GABAAR的激活，觸發(fā)神經(jīng)元的突觸后去極化[31]。由于TRN腦區(qū)的Cl-離子平衡電位高于其他腦區(qū)，因而GABAAR的激活可引起神經(jīng)元去極化，低電壓T型鈣通道被激活，從而有效控制TRN神經(jīng)元產(chǎn)生的棘波，進一步參與維持γ和θ振蕩。據(jù)報道，低電壓激活的T型鈣通道CaV3.3在TRN神經(jīng)元中大量表達[32]；低電壓T型鈣通道在TRN腦區(qū)高表達，并參與維持神經(jīng)元興奮性的閾值。因此，為進一步驗證該清醒自由活動小鼠TRN腦區(qū)γ振蕩記錄平臺，本研究進一步探究了T型鈣通道拮抗劑TTA-A2對TRN腦區(qū)γ及θ振蕩的影響。通過清醒自由活動小鼠在體多通道記錄并經(jīng)數(shù)據(jù)分析，TTAA2降低TRN腦區(qū)γ及θ振蕩的功率譜，影響了γ振蕩的維持。γ和θ振蕩的這種耦合被認為是促進認知等功能的一種協(xié)調(diào)神經(jīng)信息處理的方式，從而提示T型鈣通道參與認知及疼痛等生理功能。因此，本研究平臺將有助于探究不同腦區(qū)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)電信號產(chǎn)生、維持的機制以及新藥評價體系的建立。

神經(jīng)科學的一個主要目標是識別神經(jīng)精神障礙中的神經(jīng)回路異常，這些異常可以在動物模型中進行研究，以促進新療法的開發(fā)。場電位的細胞外記錄，是研究麻醉或清醒動物神經(jīng)元功能的首選方法[33]，同時為疾病機制研究與新藥開發(fā)提供了強有力的技術(shù)手段[34]。急性電生理記錄，不論清醒還是麻醉狀態(tài)下，不可避免存在一些與事件或行為無關(guān)的因素，如小鼠焦慮、恐懼等情緒及麻醉劑對實驗指標的影響等，難以真實反映小鼠生理狀態(tài)下的神經(jīng)活動，更不能與行為相聯(lián)系。本研究建立的清醒自由活動多通道在體記錄平臺，將電極植入到小鼠深部腦區(qū)，恢復(fù)后即可進行多次信號記錄，能夠更準確、真實地反映腦區(qū)神經(jīng)電生理特性，亦有將行為與特定腦區(qū)神經(jīng)電信號關(guān)聯(lián)起來的明顯優(yōu)勢。本平臺的難點在于小鼠顱骨小，操作窗有限，且由于解剖學特性TRN腦區(qū)范圍小。因此，如何精準定位、保護神經(jīng)元不受損傷并記錄到神經(jīng)元放電是關(guān)鍵因素。

為解決以上問題，在實驗操作過程中，首先需注意電極植入的手術(shù)過程，其次改善信號記錄時的實驗環(huán)境。本研究的解決方法為：①使用多通道電極，增加記錄到信號的概率。②植入電極過程中需注意：顱釘與顱骨連接要緊密，繞銀絲也不能使其松動；銀絲在電極植入腦組織之前繞在顱釘上，避免植入后纏繞動作擾動電極損傷大腦；需緩慢植入電極，給予腦組織足夠長的形態(tài)恢復(fù)時間，避免大腦回彈不及時壓迫腦組織，影響神經(jīng)元活性及后期記錄效果；在植入電極的過程中可利用多通道電生理系統(tǒng)實時觀察過程中電信號的變化，并尋找目標腦區(qū)范圍內(nèi)信號較強的位置；牙科水泥固定電極之前確保顱骨干燥，尤其是電極周圍，這是排除運動干擾的重要手段，必要時使用日本進口牙科水泥進行固定，防止日后電極脫落；小鼠術(shù)后應(yīng)置飼養(yǎng)籠中單獨飼養(yǎng)，避免相互之間啃食電極；同時也可以避免小鼠在飼養(yǎng)籠中活動，導致頭部電極頻繁撞擊籠蓋，影響電極穩(wěn)定。③記錄信號時盡量排除噪聲，同時將不必要的儀器斷電，在小鼠記錄箱周圍包裹錫紙或覆蓋銅網(wǎng)接地。④Plexon Control是研究人員與系統(tǒng)交互的承擔者，可實現(xiàn)信號可視化，其中的參數(shù)設(shè)置隨記錄過程中信號的變化而變化，特別強調(diào)閾值線和放大率（Mag）值2個參數(shù)，前者的設(shè)置決定了記錄到的信號，應(yīng)根據(jù)每個通道信號具體分析設(shè)定；后者是視圖內(nèi)容的垂直縮放，在可靠地觀察到尖峰放電（spike）和局部場電位中具有重要作用。注意此放大率只影響查看，不影響記錄信號。

綜上所述，本研究建立的清醒自由活動小鼠在體多通道記錄平臺，記錄了TRN腦區(qū)γ和θ振蕩，將有助于研究神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)功能，并可能為揭示神經(jīng)元同步化和疾病發(fā)生的關(guān)系提供研究平臺，并為疾病治療和新藥研發(fā)奠定技術(shù)基礎(chǔ)。該平臺的未來使用將可能直接測試大腦狀態(tài)對動物行為信息處理的影響，并有可能改善大腦疾病模型中的功能狀態(tài)。