溫度和不同抗氧化劑對花椒籽油貯藏品質及風味物質的影響

董宇晴，崔波，王斌，燕守鑫

(齊魯工業大學(山東省科學院) 食品科學與工程學院，濟南 250353)

花椒既是一種香料，又是一種中草藥，用途廣泛。大量研究表明，花椒籽油具有一定的藥理活性，包括溫胃、祛寒、除濕、止痛、解毒、止癢等[1-4]。花椒的主要化學成分是揮發油、生物堿、酰胺、木脂素、香豆素、黃酮、脂肪酸和甾醇。花椒籽是花椒調味料的主要副產物[5-6]，國內外許多研究人員對花椒籽油的脂肪酸組成進行了深入研究。結果表明，花椒籽油由棕櫚酸、棕櫚油酸、硬脂酸、亞油酸、亞麻酸和少量十七碳烯酸組成[7-9]。花椒種子油中油酸、亞油酸和亞麻酸的總含量分別為57.5%、27.9%[10]。Wang等[11]對花椒籽皮油和仁油成分進行了分析，發現花椒籽油中不飽和脂肪酸含量高達90%，高于皮油中的含量，尤其是亞油酸和亞麻酸。文獻[12]顯示:仁油中的α-亞麻酸含量為35.4%，遠高于皮油中的含量，仁油中α-亞麻酸和亞油酸之和高達64.7%。這些發現表明花椒籽油是一種極具開發潛力的油料資源[13]，可調配出脂肪構成合理的天然植物調味油產品[14]。

花椒籽油具有特殊的揮發性風味，主要包括揮發油、生物堿、酰胺類、木質素、香豆素和脂肪酸等[15-16]。特別是，風味物質酰胺類物質是花椒籽油的重要質量指標。花椒酰胺是一類結構相似的鏈狀不飽和脂肪酸酰胺類化合物[17-18]。花椒籽油在貯藏過程中酰胺類物質的變化對花椒籽油的品質有重要影響[19]。花椒酰胺將對人體的各種生理活動產生有益的影響[20]。花椒中的酰胺類化合物包括α-辣椒素、羥基-α-山奈素、羥基-β-辣椒素、γ-辣椒素、羥基-γ-辣椒素、2-羥基-N-異丁基、8-12-十四烷五烯酰胺、2-羥基-N-異丁基-2-(8)-五烯酰胺、2-羥基-N-異丁基-2-(8)-羥基-N[21]。揮發油是花椒籽油中的主要香氣物質，主要包括烯烴類化合物和烴類含氧有機化合物[22]。花椒籽油風味物質受品種、產地、溫度、光照、當地氣候等因素的影響，因此花椒籽油風味物質差異很大[23]。

研究目的：通過對貯藏溫度(4 ℃和 20 ℃)、抗氧化劑BHT、TBHQ、PG、迷迭香提取物(RE)、竹子抗氧化劑(AOB)的分析，探討貯藏溫度、抗氧化劑對花椒籽油貯藏品質的影響；采用SPME和GC-MS聯用技術，分析了不同處理對花椒籽油貯藏過程中風味物質變化的影響；采用GC分析了不同處理對花椒籽油貯藏過程中脂肪酸組成的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

花椒籽油：由淄博淄川鄂莊花椒合作社提供。TBHQ、BHT、PG、RE、AOB、異辛醇和37種脂肪酸標準混合物：購自Sigma公司。分析試劑氯仿、異丙醇、碘化鉀、冰醋酸、乙醚、濃鹽酸、氫氧化鈉、淀粉、硫代硫酸鈉、甲醇、三氟化硼甲醇溶液、正己烷和氯化鈉：購自天津凱通試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

L350烘箱 上海精宏公司；HPLC1200氣相分析儀 美國安捷倫公司；TQ8050 GC-MS分析儀 日本島津公司；BH-6 -20 ℃冰箱、DB-86 -80 ℃超低溫冰箱 青島海爾股份有限公司；HH-S4水浴鍋 江蘇省金壇市正基儀器有限公司；78-1磁力攪拌器 常州智博瑞儀器制造有限公司；5531移液器 Eppendorf艾本德公司；FA2014A分析天平 上海精天電子儀器有限公司；KDM可調控溫電熱套 山東鄄城華魯電熱儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 花椒籽油的儲存和取樣

根據國家標準規定的油脂中抗氧化劑的種類，選用了3種合成抗氧化劑(TBHQ、BHT和PG)和2種天然抗氧化劑(AOB和RE)，具體添加標準見表1。本實驗將所有樣品分為A組(4 ℃)和B組(20 ℃)，每組包含10種抗氧化劑組合。油樣中加入抗氧化劑的條件為：將0.9 kg花椒籽油放入1.5 L棕色玻璃瓶中，然后加入抗氧化劑，用磁力攪拌器攪拌30 min。最后，在規定的條件下密封存放于棕色玻璃瓶中。在第0，20，40，60，80，100 天至少檢測3個樣本的POV和AV。樣本平均值之間的差異采用鄧肯多重比較進行檢驗。數據之間的相關性分析采用Pearson雙尾相關性分析，具體分組見表1。

表1 花椒籽油的儲藏方法Table 1 The preservation methods of Chinese prickly ash seed oils

1.3.2 POV的測定

參照GB 5009.227-2016《食品安全國家標準 食品中過氧化值的測定》。

1.3.3 AV的測定

參考GB 5009.229-2016《食品安全國家標準 食品中酸價的測定》。

1.3.4 脂肪酸的甲酯化反應

甲酯化反應采用三氟化硼甲醇溶劑法[24-26]。將15 mg花椒籽油與5 mL氫氧化鈉-甲醇溶液混合，充分搖勻，然后在80 ℃的水浴中加熱60 min。在5 mL 15%(W/V)的三氟化硼-甲醇溶液中，混合物在80 ℃的水浴中回流3 min。冷卻后加入7 mL正己烷，充分搖勻，然后加入適量飽和氯化鈉溶液。最后，上清液用0.22 μm有機膜過濾，然后用GC分析。

1.3.5 GC條件

DB-WAX毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，進樣口溫度：260 ℃，進樣量：1 μL，無分流，火焰離子化檢測器溫度：260 ℃，程序升溫：起始溫度50 ℃，保溫1 min，以25 ℃/min升溫至100 ℃保溫5 min，然后以4 ℃/min升溫至240 ℃保溫30 min。載氣：N2；壓力59 kPa；氫氣：40 mL/min；空氣：400 mL/min。

1.3.6 揮發性風味成分的提取

采用固相微萃取對花椒籽油的揮發性風味成分進行提取[27-28]。將2 mL花椒籽油放入5 mL頂空瓶中，然后加入2 μL異辛醇，混合均勻，用聚四氟乙烯墊片密封。恒溫平衡20 min后，固相微萃取針穿過樣品瓶墊，將活化后的固相微萃取探針放入水浴中，以70 ℃的溫度加熱30 min。然后將固相微萃取針快速穿過進樣口的硅膠隔離器，突出纖維頭，解吸并以250 ℃注入樣品。

1.3.7 GC-MS條件

色譜柱：HP-5MS石英毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，進樣溫度：50～150 ℃(保持5 min)，升溫速率：5 ℃/min，150～280 ℃，升溫速率15 ℃/min，10 min，汽化溫度：250 ℃，載氣：氦氣，分流比：50∶1[29-30]。

質譜條件：電離方式：EI，電離電壓：70 eV，離子源溫度：250 ℃，質量掃描范圍：30 mm，400 amu。利用薄層色譜圖譜中的峰面積對風味物質進行定量，并以異辛醇為內標得到風味物質的濃度。用NIST文庫對風味成分進行定性分析。

1.3.8 統計分析

每項指標至少測量一式三份，數據以平均值±標準差(SD)表示。均數差異經方差分析和鄧肯多重極差檢驗，差異有統計學意義(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 溫度對花椒籽油貯藏期間POV和AV的影響

由圖1中a可知，隨著貯藏時間的延長，POV在4 ℃和20 ℃都呈上升趨勢。4 ℃時POV值從2.93 meq/kg增加到25.52 meq/kg，20 ℃時從2.93 meq/kg增加到30.81 meq/kg，這些變化解釋了儲藏過程中氧氣與花椒籽油反應產生過氧化物，導致POV升高[31]。研究表明，低溫對花椒籽油的酶活性有抑制作用。而在本實驗條件下，花椒籽油在儲存期小于40 d時，4 ℃和20 ℃的POV值差異不顯著(P>0.05)，花椒籽油的POV值與對照相比差異不顯著(P>0.05)。原因可能是食物內部及周圍的氧氣含量通過抗氧化劑的還原反應降低，一些抗氧化劑如抗壞血酸、異抗壞血酸等容易被氧化，可以使食物中的氧先與其反應，從而避免油脂的氧化[32]。貯藏初期抗氧化劑含量基本相同，且足以與周圍環境中的氧結合產生抗氧化作用，貯藏初期效果不顯著(P>0.05)。對于較長的儲存期(60～100 d)，4 ℃保存的花椒籽油POV值顯著低于20 ℃保存的油樣(P<0.05)，說明低溫保存有利于花椒籽油的保存。

由圖1中b可知，AV隨儲存期的延長呈上升趨勢，與儲藏溫度無關。4 ℃時AV由6.54 mg/g增至31.13 mg/g，20 ℃時由6.54 mg/g增至31.55 mg/g。這是由于隨著儲存期的延長，水將甘油三酯水解成游離脂肪酸，導致花椒籽油的AV增大。貯藏結束時，20 ℃時的AV明顯高于4 ℃時的AV(P<0.05)。

2.2 不同抗氧化劑對花椒籽油貯藏期間POV的影響

由表2可知不同的抗氧化劑對花椒籽油在儲存過程中POV的影響。空白組在第0，20，40，60，80，100 天的POV分別為2.93，6.34，12.35，19.84，24.67，30.81 meq/kg，顯著高于抗氧化劑處理組(P<0.05)，說明添加抗氧化劑能有效抑制POV的升高[33-34]。不同抗氧化劑處理對花椒籽油貯藏期間POV的影響不同[35]。在抗氧化劑處理中，TBHQ、TBHQ+BHT和TBHQ+PG在各個貯藏時間的抗氧化效果(POV值較低)均高于其他抗氧化劑[36-37]。

表2 不同抗氧化劑對花椒籽油貯藏期間POV的影響Table 2 Effects of different antioxidants on POV of Chinese prickly ash seed oils during storage

2.3 不同抗氧化劑對花椒籽油貯藏期間AV的影響

由表3可知，空白組在第0，20，40，60，80，100 天的AV分別為6.54，6.48，11.03，18.23，28.89，31.55 mg/g。通過比較9種抗氧化劑組合在每個貯藏時間的AV，解釋了影響AV的主要因素是含水率。測試樣品來自同一批次的原材料，因此含水量差異很小[38]。

表3 不同抗氧化劑對花椒籽油貯藏期間AV的影響Table 3 Effects of different antioxidants on AV of Chinese prickly ash seed oils during storage

續 表

2.4 花椒籽油貯藏過程中脂肪酸含量的變化

2.4.1 主要脂肪酸的定性和定量分析

我們選擇了3組抗氧化劑(TBHQ、TBHQ+BHT、TBHQ+PG)來分析儲存在4 ℃時的脂肪酸。本實驗通過36種脂肪酸混合標準的氣相色譜分析[39]，得到36種脂肪酸的峰高和36種脂肪酸的濃度，見表4。

表4 36種標準脂肪酸的標準曲線Table 4 The standard curves of 36 standard fatty acids

續 表

2.4.2 抗氧化處理對花椒籽油貯藏過程中脂肪酸含量的影響

由表5～表7可知，在第0，20，40，60，80，100 天時，TBHQ、TBHQ+BHT、TBHQ+PG組合中檢測到23種脂肪酸。第0天時，主要脂肪酸為棕櫚酸、亞油酸和甲基花生酸，分別占脂肪酸總量的50.13%、35.29%和3.43%。3個組合的棕櫚酸含量分別由50.13%降至45.03%、43.1%和41.11%，總體趨勢是下降趨勢。亞油酸含量由35.29%分別降至30.06%、30.03%和32.01%，總體趨勢是下降趨勢。甲基花生酸含量由3.43%分別降至1.56%、0.73%和0.59%，總體走勢比較平穩。肉豆蔻酸含量由0.78%分別提高到1.94%、1.51%和1.71%，總體趨勢是上升趨勢。結果表明，添加3種抗氧化劑對主要脂肪酸沒有顯著影響[40]。據報道，脂肪酸的組成和變化受原產地環境、儲存方式和環境的影響。

表5 TBHQ組合花椒籽油在4 ℃儲藏過程中脂肪酸組成的變化Table 5 Changes in fatty acid composition of Chinese prickly ash seed oils containing TBHQ during storage at 4 ℃

續 表

表6 TBHQ+BHT組合花椒籽油在4 ℃儲藏過程中脂肪酸組成的變化Table 6 Changes in fatty acid composition of Chinese prickly ash seed oils containing TBHQ+BHT during storage at 4 ℃

表7 TBHQ+PG組合花椒籽油在4 ℃儲藏過程中脂肪酸組成的變化Table 7 Changes in fatty acid composition of Chinese prickly ash seed oils containing TBHQ+PG during storage at 4 ℃

續 表

將檢測到的脂肪酸分為飽和脂肪酸、單不飽和脂肪酸、多不飽和脂肪酸。3個組合中飽和脂肪酸主要是甲基硬脂酸，含量分別由1.02%至1.20%、0.88%和4.65%，總體變化態勢比較平穩。單不飽和脂肪酸主要為棕櫚酸，棕櫚酸含量分別由50.13%降至45.03%、43.1%和41.1%，總體趨勢是下降的。多不飽和脂肪酸以亞油酸為主，亞油酸含量由35.29%分別降至30.06%、32.03%和32.01%，總體呈下降趨勢。綜合分析，第0天的飽和脂肪酸含量高于第100天，第0天的不飽和脂肪酸含量低于第100天，3種抗氧化劑的添加對主要脂肪酸的影響不顯著。

2.5 花椒籽油貯藏過程中風味物質的變化

主成分分析(PCA)是一種多元統計方法，它利用降維的思想，在信息損失較少的前提下，將多個指標轉化為多個綜合指標，它被廣泛應用于指標變量的相關性分析[41]。花椒籽油不同儲存期的揮發性成分峰面積相對離散，因此采用主成分分析法進行標準化處理，使數據更加簡潔，不影響結果。

用GC-MS分析了TBHQ混合物中的揮發性風味物質[42]。以異辛醇為內標對風味物質進行定量分析，利用NIST譜庫對風味物質進行定性分析，共檢測出19種揮發性風味物質，并對19種風味物質進行主成分分析，見表8。

表8 TBHQ處理花椒籽油儲藏過程中揮發性成分的GC-MS測定Table 8 The volatile components of Chinese prickly ash seed oils treated with TBHQ during storage determined by GC-MS

由表9可知，第一主成分的方差貢獻率為52.493%，第二主成分的方差貢獻率為23.697%，第三主成分的方差貢獻率為12.267%。一般來說，當主成分的累計貢獻率超過85%時，可以用主成分來表示原始數據。因此，這3個主成分基本能反映原始變量的信息。

表9 提取的主成分的特征值和貢獻率Table 9 The eigenvalues and contribution rates of the extracted principal components

由表10可知，在TBHQ處理的花椒籽油中，第一主成分為β-月桂烯、α-水芹烯、桉樹醇、庚酸、環己烯、石竹烯、己酸、2-甲基環己酮、十四烷、十八酸、豆甾醇、二十二烷、角鯊烯，第二主成分為β-水芹烯、花黃素、2-環己烯-1-甲醇，第三主成分為乙酸芳樟酯、豆甾醇。

表10 TBHQ+BHT處理花椒籽油儲藏過程中揮發性成分的GC-MS測定Table 10 The volatile components of Chinese prickly ash seed oils treated with TBHQ+BHT during storage determined by GC-MS

由表11可知，第一主成分的方差貢獻率為44.344%，第二主成分的方差貢獻率為24.059%，第三主成分的方差貢獻率為18.887%。一般來說，當主成分的累計貢獻率超過85%時，可以用主成分來表示原始數據。因此，前3個主成分基本能反映原始變量的信息。

表11 提取的主成分的特征值和貢獻率Table 11 The eigenvalues and contribution rates of the extracted principal components

由表12可知，TBHQ+BHT處理的花椒種子油中，第一主成分是β-月桂烯、α-水芹烯、桉樹醇、庚酸、石竹烯、花黃素、2-甲基環己酮、氧化石竹烯、十八酸、γ-谷甾醇，第二主成分是β-水芹烯、乙酸芳樟酯、環己烯、2-環己烯-1-甲醇、十四烷、豆甾醇，第三主成分是己酸、二十二烷。

表12 TBHQ+PG處理花椒籽油貯藏過程中揮發性成分的GC-MS測定Table 12 The volatile components of Chinese prickly ash seed oils treated with TBHQ+PG during storage determined by GC-MS

續 表

由表13可知，TBHQ+PG處理的花椒籽油中只有一個主成分被提取，因此不能對TBHQ+PG處理的花椒籽油進行主成分分析。

表13 提取的主成分的特征值和貢獻率Table 13 The eigenvalues and contribution rates of the extracted principal components

3 結論

在4 ℃和20 ℃條件下，花椒籽油的POV值隨著貯藏時間的延長而增加，抗氧化劑的加入顯著降低了花椒籽油的POV值。TBHQ、TBHQ+BHT和TBHQ+PG 3個組合在4 ℃和20 ℃時的POV均較低，且3個組合的TBHQ、TBHQ+BHT和TBHQ+PG在4 ℃時的POV均低于20 ℃時的POV。隨著儲藏期的延長，AV不斷增加，低溫對AV的增加有抑制作用。添加抗氧化劑對AV的影響較小。本研究為延長花椒種子油的儲存期，提高花椒種子油的品質提供了一定的理論借鑒。

采用脂肪酸GC分析，對貯藏于4 ℃的花椒籽油進行GC分析，通過分析花椒籽油TBHQ、TBHQ+BHT和TBHQ+PG 3個組成的脂肪酸，發現添加3種抗氧化劑對主要脂肪酸的影響不大。花椒籽油在第0天的飽和脂肪酸含量高于第100天，第0天的不飽和脂肪酸含量低于第100天，為花椒籽油儲藏期脂肪酸的變化提供了一定的理論依據，對花椒油儲藏具有一定的指導意義。

采用SPME和GC-MS技術分析了TBHQ、TBHQ+BHT和TBHQ+PG處理4 ℃花椒籽油的風味物質，并用主成分分析法對揮發性物質進行了分析。已知TBHQ處理花椒籽油的第一主成分為β-月桂烯、α-水芹烯、桉樹醇、庚酸、環己烯、己酸、2-甲基環己酮、十四烷、石竹烯、十八酸、豆甾醇、二十二烷、角鯊烯，第二主成分為β-水芹烯、花黃素、2-環己烯-1-甲醇，第三主成分為乙酸芳樟酯、豆甾醇。TBHQ+BHT處理花椒籽油的第一主成分主要為β-月桂烯、α-水芹烯、桉樹醇、庚酸、花黃素、2-甲基環己酮、氧化石竹烯、十八酸、γ-谷甾醇，第二主成分為β-水芹烯、乙酸芳樟酯、環己烯、2-環己烯-1-甲醇、十四烷、豆甾醇，第三主成分是己酸、二十二烷。