紅樹莓凍干粉中酚類化合物含量測定及其抗氧化活性研究

王娜，韓海霞，鐘志明，王娟

(新疆農業大學 食品科學與藥學學院，烏魯木齊 830052)

紅樹莓(RubusidaeusL.)又名覆盆子，薔薇科懸鉤子屬類植物[1]，含有多種有益的化合物，包括必需礦物質、維生素、脂肪酸和膳食纖維，以及廣泛的酚類化合物[2]，紅樹莓中酚類物質有花青素、鞣花單寧、黃酮醇(槲皮素)、黃烷醇(兒茶素)、原花青素(原花青素B2)、羥基肉桂酸(沒食子酸)等，具有抗氧化、抗炎、抗菌的生物活性[3-4]。

酚類化合物對因產生過氧化作用而導致生物體在結構和功能上損傷的DPPH自由基、羥基自由基和ABTS+自由基等有顯著的清除作用，還能與金屬形成螯合物，是天然的抗氧化劑[5]。前人研究發現，酚類化合物作為天然抗氧化劑對提高肉類和肉制品貨架壽命和脂質穩定性有積極的作用，同時還具有增強食品風味、去除臭味等功能，在食品工業中應用具有廣闊的前景。酚類化合物還能通過信號轉導途徑調控腫瘤抑制基因或致癌基因的表達等，具有抗衰老、抗腫瘤、抗炎、抗抑郁、抑菌、調節血脂和提高免疫力等生物學特性[6]。

盡管酚類化合物應用廣泛，但其在水果和蔬菜中含量都較低。目前對紅樹莓中酚類化合物的含量和抗氧化能力的高低，以及對人類健康和營養的好處還未見報道。本研究采用紫外分光光度法(ultraviolet absorption spectrophotometry，UV)和高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)測定紅樹莓凍干粉中酚類化合物含量，并研究其抗氧化的藥用價值，為紅樹莓凍干粉在食品領域的進一步開發利用提供了理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅樹莓凍干粉的制備：將購于新疆伊犁的新鮮紅樹莓打漿后在-55 ℃冷凍干燥24 h，過80目篩，其質量為紅樹莓鮮重的12.35%，呈淡紅色的狀態疏松，封裝備用。

標準品沒食子酸、兒茶素、原花青素B2、蘆丁、鞣花酸、槲皮素：均購于成都麥德生科技有限公司；福林酚：購于上海麥克林生化科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)、2,2′-聯氨-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺鹽(ABTS)：均購于上海如吉生物科技有限公司；抗壞血酸(分析純)：購于天津市北辰方正試劑廠；超純水(自制)；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

島津LC-20A高效液相色譜儀、DAD 檢測器；XPE105電子分析天平(0.01 mg) 梅特勒-托利多(上海)有限公司；80-1電動離心機 金壇市恒豐儀器廠；T6紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限公司；KQ-250DE超聲清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；YKW-303恒溫搖床 長沙永樂康儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品溶液前處理

準確稱取1 g紅樹莓冷凍干燥粉于50 mL燒杯中，加入75%乙醇30 mL，封口，超聲提取20 min，離心15 min，即為樣品溶液。

1.3.2 總多酚含量的測定

采用福林-酚比色法測定總多酚含量[7]。

1.3.3 總黃酮含量的測定

采用亞硝酸鈉-硝酸鋁比色法測定總黃酮含量[8]。

1.3.4 花青素含量的測定

采用pH示差法測定花青素含量[9]。

1.3.5 標準品溶液的制備

精密稱取沒食子酸、兒茶素、原花青素B2、蘆丁、鞣花酸、槲皮素對照品適量，用二甲基亞砜溶解，制成濃度分別為沒食子酸6 μg/mL、兒茶素15 μg/mL、原花青素B220 μg/mL、蘆丁10 μg/mL、鞣花酸20 μg/mL、槲皮素0.5 μg/mL的混合對照品溶液。

1.3.6 HPLC測定方法

沒食子酸、兒茶素、原花青素B2、蘆丁、鞣花酸、槲皮素的測定方法：Target TC-18色譜柱(4.6 mm×150 mm, 5 μm)；流動相采用甲醇(A)-0.1% 甲酸(B)梯度洗脫，0～2 min，5% A→10% A；2～5 min，10% A→18% A；5～15 min，18% A →30% A；15～32 min，30% A→55% A；32～42 min，55% A→80% A；流速1.0 mL/min；進樣量10 μL；柱溫25 ℃；檢測波長分別為沒食子酸273 nm、兒茶素270 nm、原花青素B2280 nm、蘆丁390 nm、鞣花酸254 nm、槲皮素254 nm。

1.3.7 體外抗氧化活性

1.3.7.1 羥自由基清除能力的測定

參照蔡惠鈿等[10]的方法稍作修改。

1.3.7.2 DPPH自由基清除能力的測定

參照張玲玲等[11]的方法稍作修改。

1.3.7.3 ABTS+自由基清除能力的測定

參照米雪等[12]的方法稍作修改。

1.3.7.4 還原能力的測定

參照米雪等的方法稍作修改。

2 結果與分析

2.1 UV法測定總多酚、總黃酮和花青素含量

根據實驗檢測結果，以縱坐標為吸光度，橫坐標為沒食子酸和蘆丁標準品溶液濃度，繪制標準曲線。福林-酚比色法測得總多酚含量的標準曲線回歸方程為：Y=0.0128X+0.0858，R2=0.9995，總多酚的含量為72.2 mg/g，高于Anttonen M J等測得的35.9 mg/g[13]；亞硝酸鈉-硝酸鋁比色法測得總黃酮含量的標準曲線回歸方程為：Y=0.0106X+0.026，R2=0.9995，總黃酮含量為10.84 mg/g，高于Saifullah M等測得的4.1 mg/g[14]；pH示差法測得花青素含量為0.18 mg/g，低于Si Xu等測得的0.54 mg/g[15]。

2.2 HPLC法測定酚類物質含量

2.2.1 線性關系、精密度、重復性和穩定性試驗

由表1可知，儀器精密度、重復性好，穩定性和線性關系均良好，符合分析要求。

表1 線性關系、精密度、重復性和穩定性試驗考察結果(n=6)Table 1 The linear relation, precision, repeatability and stability test results(n=6)

2.2.2 加樣回收率試驗

取已知含量的紅樹莓凍干粉末9份，每份約1.0 g，精密稱定。精密加入已知濃度的混合對照品溶液；按1.3.1項下方法制成低、中、高3個質量濃度的樣品溶液，在1.3.3項色譜條件下進行色譜分析，計算RSD，結果見表2。

表2 加樣回收率試驗結果Table 2 The recovery rate test results of samples

由表2可知，6種多酚類成分的加樣回收率范圍在97.1%～99.3%，RSD均小于5%，其回收率和RSD符合分析的要求。

2.2.3 HPLC測定結果

取對照品和供試品溶液經0.45 μm濾膜超濾后進樣測定，色譜圖見圖1。定量方法采用外標法，結果見表3。

A

由表3可知，測得紅樹莓中的沒食子酸含量高于孟實等測得的0.14 μg/g[16]，但低于Mayara Schulza等測得的0.74 mg/g[17]；兒茶素低于孟實等測得的4.81 μg/g,但高于Mayara Schulza等測得的0.73 μg/g；原花青素B2低于孟實測得的1.92 μg/g；鞣花酸0.64 μg/g高于孟實測得的0.51 μg/g；槲皮素的含量低于Mayara Schulza等測得的1.5 μg/g；紅樹莓中蘆丁含量測定目前還未見報道，酚類物質含量的差異可能是由于品種、環境和地理差異造成的。

表3 紅樹莓凍干粉的HPLC含量測定結果Table 3 The content determination results of Rubus idaeus L. lyophilized powder by HPLC

2.3 紅樹莓凍干粉體外抗氧化活性結果

2.3.1 羥基自由基清除能力

羥基自由基具有很高的反應活性，被認為是對生物體有害的氧化劑。羥基自由基會嚴重破壞鄰近的生物分子，從而導致DNA、脂質和蛋白質的氧化破壞。因此，除去羥基自由基對于保護生命系統至關重要[18]。

由圖2可知紅樹莓凍干粉和對照VC對羥基自由基的清除能力。紅樹莓凍干粉的濃度從0.0625 mg/mL增加到1 mg/mL，與羥自由基清除能力表現出明顯的劑量-效應關系。在0.0625～0.25 mg/mL的濃度范圍內，紅樹莓凍干粉的羥基自由基清除能力高于VC，但隨著濃度的增大，紅樹莓的羥基自由基清除能力低于VC，當紅樹莓凍干粉的濃度達到1 mg/mL時，清除率達到73.56%。由此可知，在一定的濃度范圍內，紅樹莓凍干粉的羥基自由基清除能力高于對照組VC。

圖2 紅樹莓凍干粉對羥基自由基的清除能力Fig.2 The scavenging ability of Rubus idaeus L. lyophilized powder on hydroxyl radical

2.3.2 DPPH自由基清除能力

DPPH自由基清除能力是基于抗氧化劑的氫供體能力。它通過測量簡單性，快速性和敏感性廣泛用于測試各種抗氧化劑樣品的抗氧化能力[19]。

由圖3可知紅樹莓凍干粉和對照Vc對DPPH自由基的清除能力。結果表明，紅樹莓凍干粉對DPPH自由基的清除能力具有濃度依賴性，當紅樹莓凍干粉濃度從0.0625～1 mg/mL增加時，劑量-效應關系明顯，當紅樹莓濃度為1 mg/mL時，清除率達到73.84%，對照組Vc隨著濃度的升高其DPPH自由基的清除能力變化不顯著，而紅樹莓凍干粉對DPPH自由基的清除能力始終低于Vc。

圖3 紅樹莓凍干粉對DPPH 自由基的清除能力Fig.3 The scavenging ability of Rubus idaeus L. lyophilized powder on DPPH radical

2.3.3 ABTS+·清除能力

ABTS法用于測定生物樣品的抗氧化能力。ABTS+·經活性氧氧化后生成穩定的藍綠色陽離子自由基ABTS+·，向其中加入被測物質,如果該物質中存在抗氧化成分，則該物質會與ABTS+·發生反應而使反應體系褪色[20]。與其他幾種抗氧化能力的體外測定法相比，ABTS法快速、簡便，與抗氧化劑的生物活性相關性強，因而被廣泛地應用于物質的抗氧化能力測定。

由圖4可知紅樹莓凍干粉和對照Vc對ABTS+·的清除能力。紅樹莓的ABTS+·具有濃度依賴性。當紅樹莓凍干粉濃度為1 mg/mL 時，對ABTS+·的清除率達到66.15%，但ABTS+·的清除率始終低于Vc。

圖4 紅樹莓凍干粉對ABTS+·的清除能力Fig.4 The scavenging ability of Rubus idaeus L. lyophilized powder on ABTS+·

2.3.4 還原能力的測定

抗氧化劑與還原能力之間有直接的相關性，還原劑可以與某些過氧化物的前體反應，防止了過氧化物的形成[21]。因此，化合物或提取物的還原能力是目前應用最為廣泛的抗氧化活性的指標之一。

由圖5可知紅樹莓凍干粉和對照Vc的還原能力，還原能力與紅樹莓凍干粉的濃度呈正相關。紅樹莓凍干粉濃度和VC濃度從0.0625～1 mg/mL，還原能力隨著濃度的增大而不斷增加，但是與VC的還原能力相比，紅樹莓凍干粉的還原能力始終低于VC。但紅樹莓凍干粉的濃度升高到一定程度之后是否會高于VC有待我們進一步試驗的驗證。

圖5 紅樹莓凍干粉的還原能力Fig.5 The reducing power of Rubus idaeus L. lyophilized powder

2.4 紅樹莓凍干粉中酚類化合物與抗氧化活性的相關性分析

根據前面的實驗結果，我們將紅樹莓凍干粉中的酚類物質與抗氧化能力進行相關性分析，結果見圖6。

圖6 紅樹莓凍干粉中酚類化合物與抗氧化活性的相關性分析Fig.6 Correlation analysis of phenolic compounds and antioxidant activity of Rubus idaeus L. lyophilized powder

由圖6可知，原花青素B2與還原力和DPPH·呈負相關，相關系數分別為0.93和0.96。沒食子酸與羥基自由基呈正相關，相關系數為1；對ABTS+·與還原力呈負相關，分別為0.89和0.85。兒茶素與羥基自由基呈正相關，相關系數為0.94；與ABTS+·呈負相關，相關系數為1。蘆丁對羥基自由基呈正相關，相關系數為1；對ABTS+·呈負相關，相關系數為0.94。鞣花酸對羥基自由基、DPPH·、ABTS+·和還原力的影響均較小。槲皮素對ABTS+·呈正相關，相關系數為0.99；對羥基自由基呈負相關，相關系數為0.85。對羥基自由基影響最大的為蘆丁。對ABTS+·影響最大的為槲皮素和兒茶素，且槲皮素和兒茶素呈負相關，且相關系數為0.98。對還原力和DPPH·影響最大的為原花青素B2，且還原力和DPPH·呈正相關，相關系數為1。綜上可知，槲皮素、兒茶素、蘆丁和沒食子酸對ABTS+·和羥基自由基清除能力的影響較大，蘆丁、沒食子酸和原花青素B2對還原力和DPPH·的影響較大，而鞣花酸對抗氧化活性均無較大影響，說明蘆丁和沒食子酸的含量對抗氧化活性的影響較為明顯，且蘆丁和沒食子酸的相關系數為0.99。

3 結論

近年來，隨著對具有抗氧化特性的水果生化含量的研究，人們對水果在人類健康和營養中的重要作用有了更深入的認識。本研究采用UV法和HPLC法測得紅樹莓凍干粉中總多酚、總黃酮和花青素含量分別為72.2，10.84，0.18 mg/L，6種酚類物質含量高低為原花青素B2>鞣花酸>兒茶素>沒食子酸>蘆丁>槲皮素。在抗氧化活性實驗中，槲皮素、兒茶素、蘆丁和沒食子酸對ABTS+·和羥基自由基清除能力的影響較大，而蘆丁、沒食子酸和原花青素B2對還原力和DPPH·的影響較大，而鞣花酸對抗氧化活性均無較大影響，說明蘆丁和沒食子酸的含量對抗氧化活性的影響較為明顯，且蘆丁和沒食子酸的相關系數為0.99。這些結果突出了紅樹莓具有良好的抗氧化活性，所獲得的凍干粉可以被用作天然著色劑或抗氧化劑，并將其作為穩定和多功能的成分被應用于食品、化妝品和制藥工業。由此如果紅樹莓凍干粉作為功能性食品中的成分，它可能會產生很大的吸引力。