小米綠豆醋的糖化工藝研究

文明，王毛毛，王雪婷，王如福

(山西農業大學 食品科學與工程學院，山西 晉中 030801)

綠豆(PhaseolusradiatusL.)，屬于豆科、蝶形花科(Papilionoideae)、菜豆族(Phaseoleae)、豇豆屬(Vigna)中的一個種，是溫帶地區廣泛種植的豆類之一[1]。綠豆營養豐富，籽粒中蛋白質含量高達19.5%～33.1%，明顯高于禾谷類作物，到目前為止已從綠豆中鑒定出多種化合物，如黃酮類、花青素、皂苷、植物甾醇等[2]。

小米(Setariaitalica)，又稱粟米，是禾本科(Gramineae)、狗尾草屬(Setaria)植物，直徑約1 mm，屬雜糧作物，是世界上最古老的雜糧作物之一[3]。小米營養豐富，主要含有多酚、蛋白質、不飽和脂肪酸和各種礦物質等，營養素搭配合理，人體利用消化率高[4-5]。

食醋是一種酸性調味品，采用傳統發酵工藝釀造，不僅具有獨特的風味，而且富含營養及多種功能因子。傳統食醋中的抗氧化活性成分有多酚、黃酮、蛋白黑素和川芎嗪等，可以抵抗機體的氧化應激，具有預防心血管疾病、抗癌、抗衰老和保護肝臟的作用。隨著人們生活水平及對食醋營養價值、保健功能認識的提高，單一的食醋品種已不能滿足不同層次、不同消費者的需求。小米和綠豆除了具有豐富的蛋白質以外還有大量的淀粉，所以其能夠作為食醋釀造的原料，由于人體在消化和吸收蛋白質過程中，蛋白中的各種氨基酸需要合適的比例才能夠充分地被吸收和利用，而當某種蛋白中的氨基酸不能達到這一比例時，即使食物中蛋白質含量再高，也不能被人體充分利用[6-7]。因為賴氨酸為小米的第一限制性氨基酸[8]，而綠豆的賴氨酸含量較高，基于上述理論，可以選擇綠豆作為小米蛋白利用價值的互補原料。

目前國內外，對于小米和綠豆的研究大多集中在功能成分上或是某一種原料的產品加工上，朱文學等[9]通過超聲波輔助水提工藝提取綠豆皮中的黃酮類物質，最佳提取工藝為超聲功率419 W、超聲溫度70 ℃、超聲時間75 min、料液比1∶45(g/mL)；Sharma等[10]研究發現，小米多酚對金黃色葡萄球菌、糞腸球菌、蠟狀芽孢桿菌和腸膜明串珠菌的生長均具有抑制作用；潘潔瓊等[11]通過正交試驗對固態法小米醋釀造工藝進行了優化，最終釀造出的小米醋小米香味突出、酸味柔和。但是對于小米和綠豆發酵產品的研究還有所缺失，所以對于小米綠豆糖化液的研究顯得意義重大。在小米綠豆發酵產品的釀造過程中，糖化階段是一個保留功能成分和進一步發酵的重要階段，因為在加熱蒸煮的過程中會導致許多功能成分的損失以及影響到微生物的生長代謝，從而直接影響后續發酵產品的品質，所以本試驗將對小米綠豆糖化液的制備進行工藝優化。

本試驗以小米、綠豆和高粱為原料，以氨基酸態氮、還原糖和總黃酮為評價指標。通過對單因素的分析、Plackett-Burman試驗及響應面法優化小米綠豆的糖化工藝，旨在確定小米綠豆糖化的最佳工藝，為進一步研究小米綠豆醋提供了理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小米：產自山西省長治市沁縣；綠豆：產自山西省大同市云州區；α-淀粉酶(1×105U/g)；糖化酶(4×105U/g)；酸性蛋白酶(1×105U/g)；蘆丁標準品(純度≥98%)：北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設備

DS-1組織搗碎機 上海昂尼儀器儀表有限公司；電熱恒溫水浴鍋 上海博迅實業有限公司醫療設備廠；Starter 2C pH計 奧豪斯儀器(上海)有限公司；722型可見光分光光度計 上海舜宇恒平科學儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 工藝流程

1.3.2 單因素試驗

以氨基酸態氮、還原糖和總黃酮含量為指標，固定因素水平為α-淀粉酶添加量為200 U/g，液化時間為40 min，液化溫度為70 ℃，糖化酶添加量為1500 U/g，糖化時間為50 min，糖化溫度為70 ℃，加水量為300%，蛋白酶添加量為1000 U/g，高粱添加量為10%。設置單因素試驗：α-淀粉酶添加量(0，100，200，300，400 U/g)、液化時間(10，20，30，40，50 min)、液化溫度(60，70，80，90，100 ℃)、糖化酶添加量(500，1000，1500，2000，2500 U/g)、糖化時間(30，40，50，60，70 min)、糖化溫度(55，60，65，70，75 ℃)、加水量(200%、300%、400%、500%、600%)、蛋白酶添加量(100，200，300，400，500 U/g)、高粱添加量(0%、5%、10%、15%、20%)9個因素對小米綠豆糖化醪的氨基酸態氮、還原糖和總黃酮含量的影響。

1.3.3 Plackett-Burman試驗

在單因素試驗結果的基礎上確定各個因素的范圍，以小米綠豆糖化醪還原糖和總黃酮的綜合評分為響應值，通過Plackett-Burman試驗從9個因素中選出對小米綠豆糖化醪有顯著影響的因素。

1.3.4 響應面試驗設計

基于PB試驗的結果，選取α-淀粉酶添加量、液化時間、糖化酶添加量、糖化時間4個影響顯著的因素，以小米綠豆糖化醪還原糖和總黃酮含量的綜合評分為響應值，試驗設計見表1。

表1 響應面試驗因素及水平Table 1 The factors and levels of response surface test

1.3.5 測定方法

還原糖含量的測定：通過3,5-二硝基水楊酸(DNS)比色法進行測定[12]。葡萄糖標準曲線的回歸方程為：y=1.4165x-0.0386，R2=0.9966。

總黃酮含量的測定：參考GB/T 19777-2013，建立標準曲線回歸方程y=0.431x-0.0082，R2=0.9974，其中y為吸光值，x為蘆丁質量。

氨基酸態氮含量的測定：參考GB/T 13662-2018。

1.3.6 綜合評分

小米綠豆糖化醪還原糖和總黃酮含量的綜合評分標準見表2。

表2 綜合評分標準Table 2 The comprehensive scoring standards

1.3.7 數據處理

采用Design-Expert 10以及Origin 9處理數據。

2 結果與分析

2.1 小米綠豆糖化單因素試驗結果

2.1.1 α-淀粉酶添加量、液化時間及液化溫度的確定

由圖1中a可知，隨著α-淀粉酶添加量的增加，氨基酸態氮的含量無明顯變化，還原糖與總黃酮含量逐漸增加最終趨于平緩，這是因為黃酮類物質與α-淀粉酶可通過疏水作用、氫鍵或范德華力產生結合作用，其結合到酶的非活性中心部位，對α-淀粉酶表現出非競爭性抑制[13]，隨著黃酮含量的增加，導致對α-淀粉酶的抑制性增強，使得還原糖含量的增長趨于平緩。

a

由圖1中b可知，液化時間對小米綠豆糖化醪的影響顯著(P≤0.05)，氨基酸態氮含量則變化不明顯，總黃酮含量先升高后降低，還原糖含量在10～40 min時增長迅速，在40 min后增長平緩，主要是因為淀粉的液化過程大致分為兩個階段：最初α-淀粉酶作用于直鏈淀粉使其迅速分解，黏度快速降低；其次，再作用于支鏈淀粉產生葡萄糖和糊精等，同時促進寡糖緩慢地分解為葡萄糖，從而促進支鏈淀粉的液化，后一反應比第一階段要慢[14]，所以在40 min后還原糖含量增長逐漸平緩。

由圖1中c可知，隨著溫度的上升，氨基酸態氮含量略微下降，總黃酮含量逐漸升高而后趨于平緩，受氧化影響導致總黃酮含量有所下降[15]。在80 ℃時還原糖含量達到最大值，但其隨后逐漸降低，其原因是還原糖與氨基酸發生了美拉德反應。

2.1.2 糖化酶添加量、糖化時間及糖化溫度的確定

由圖2中a可知，氨基酸態氮幾乎不受糖化酶添加量的影響。在糖化酶添加量為1500 U/g時總黃酮含量開始逐漸下降，其原因是隨著糖化酶含量的增加，逐漸將總黃酮水解為異黃酮苷[16]。在糖化酶添加量為500～1500 U/g時，還原糖含量增長迅速，在1500～2500 U/g范圍內還原糖含量增長緩慢，原因是在糖化酶添加量低于1500 U/g時，糖化酶與底物充分反應導致糖化反應受酶添加量的影響較大，當糖化酶含量大于1500 U/g時，糖化酶的添加量已過量，所以還原糖含量增長緩慢。

a

由圖2中b可知，在糖化前期，氨基酸態氮的含量基本不受影響，然而總黃酮含量與還原糖含量逐漸增加，但隨著時間的增加，糖化酶作用的底物濃度逐漸降低，使得還原糖含量在60 min后增長變緩，這時糖化酶則對總黃酮進行水解，導致總黃酮含量下降。

由圖2中c可知，隨著溫度的逐漸升高，氨基酸態氮含量略微下降，總黃酮和還原糖含量先升高后下降，其主要原因是溫度過高導致糖化酶活性降低使得還原糖含量下降，受氧化影響導致總黃酮含量下降。

2.1.3 高粱添加量、蛋白酶添加量及加水量的確定

由圖3中a可知，隨著高粱添加量的增加，氨基酸態氮的含量逐漸減小，而總黃酮和還原糖的含量隨著高粱添加量的增加逐漸增大，原因是高粱的支鏈淀粉含量高于小米和綠豆，所以隨著其添加量的增加還原糖的含量也隨之增加，并且高粱淀粉的加入使得糊化穩定性增強[17]。

由圖3中b可知，隨著蛋白酶添加量的增加，還原糖和氨基酸態氮的含量逐漸上升，總黃酮的含量先上升后趨于平緩，其作用機理是蛋白酶作用于原料中的蛋白質，使得與蛋白質相結合的黃酮類物質析出，導致氨基酸態氮和黃酮類物質含量上升[18]。

a

由圖3中c可知，隨著加水量的增加，還原糖、總黃酮含量都先增加后減少，其作用機理是蛋白質含有-COOH、-NH3、-OH等親水性基團，所以加水量少時導致小米綠豆醪液黏稠使得還原糖、總黃酮含量不易析出[19]，而加水量過多會導致還原糖、總黃酮和氨基酸態氮濃度過低。

2.1.4 參數確定

通過對單因素結果的分析確定α-淀粉酶添加量為300 U/g，液化時間為40 min，液化溫度為80 ℃，糖化酶添加量為1500 U/g，糖化時間為60 min，糖化溫度為60 ℃，高粱添加量為15%，蛋白酶添加量為300 U/g以及加水量為原料的400%，由于氨基酸態氮在糖化階段相對穩定，所以在后續的試驗中不再將其設置為考察指標。

2.2 Plackett-Burman試驗確定關鍵影響因素

以小米綠豆糖化醪還原糖含量和總黃酮含量為響應值，試驗設計及結果見表3。

表3 Plackett-Burman試驗設計及結果Table 3 Plackett-Burman test design and results

由表3可知，分別以還原糖、總黃酮為響應值建立回歸模型顯著。回歸模型方程為：還原糖含量=-0.20+0.005130A+0.03157B-0.00021C+0.001051D+0.08305E+0.0281F+0.000478G+0.001407H+0.0046I；總黃酮含量=115.65-0.05233A-0.2768B+0.1069C+0.000502D+0.0527E+0.0790F-0.00432G+0.01226H-0.0916I；兩模型的R2分別為0.9915，0.9954，表明模型具有統計學意義。

由表4可知，α-淀粉酶添加量對還原糖含量的影響顯著，對總黃酮含量的影響極顯著，液化時間對總黃酮含量的影響顯著，糖化酶添加量對還原糖含量的影響顯著，糖化時間對還原糖含量的影響極顯著。所以PB試驗篩選出主要影響因素為A α-淀粉酶添加量、B 液化時間、D糖化酶添加量和E糖化時間。

2.3 響應面試驗結果

以小米綠豆糖化醪還原糖和總黃酮含量的綜合評分指標為響應值，采用Box-Behnken試驗和響應面分析，對試驗結果進行處理和分析，結果見表5。

表5 Box-Behnken試驗設計及結果Table 5 Box-Behnken test design and results

續 表

經過回歸擬合后得到小米綠豆糖化醪以綜合評分為響應值的回歸方程為：綜合評分=+88.42+2.45A+1.31B+4.69C+9.17D-0.89AB-2.62AC-2.41AD-2BC-2.09BD-0.66CD-10.02A2-9.9B2-5.45C2-6.84D2，其中R2為0.9904，表明其因變量與其他自變量之間的多元關系顯著，RAdj2和 RPred2分別為0.9807和0.9460，兩者之間的差距小于0.2，所以該模型可信，則上述回歸方程可以預測4個因素對小米綠豆糖化工藝的影響。

表6 小米綠豆糖化醪綜合評分方差分析表Table 6 Analysis of variance of the comprehensive scores of millet and mung bean saccharifying mash

續 表

由表6方差分析結果可知，該模型回歸關系顯著，各因素對其綜合評分的影響大小為：糖化時間>糖化酶添加量>α-淀粉酶添加量>液化時間。

各因素及其交互作用對小米綠豆糖化醪綜合評分的影響結果可以通過響應面圖直觀地反映出來，其中圖像底部的等高線可以反映兩因素相互作用的強弱，若是橢圓形則表示相互作用較強，圓形則表示較弱[20]。由圖4可知AB和CD的等高線為圓形，說明其交互作用對小米綠豆糖化醪綜合評分的影響不顯著，而AC、AD、BC以及BD為橢圓形，則說明其交互作用顯著，這與表6中的結果相符合。

由回歸方程擬合得到的小米綠豆糖化的最優工藝條件為：α-淀粉酶添加量為306.927 U/g，液化時間為39.174 min，糖化酶添加量為1700.517 U/g，糖化時間為61.347 min，在此條件下小米綠豆糖化醪的綜合評分理論值為90.16分，還原糖含量為13.423 g/dL，總黃酮含量為163.745 mg/dL。結合實際生產需要將工藝調整為α-淀粉酶添加量307 U/g、液化時間39 min、糖化酶添加量1700 U/g、糖化時間61.5 min。在此條件下進行3次驗證，得到糖化醪還原糖含量為12.85 g/dL，總黃酮含量為156.14 mg/dL，綜合評分為87.32分，與預測值相比誤差為3.15%，由此說明該模型的擬合程度良好，得到的小米綠豆糖化工藝參數可靠。

3 結論

該試驗對小米綠豆糖化工藝進行了優化，在單因素試驗的基礎上進行Plackett-Burman試驗，篩選出α-淀粉酶添加量、液化時間、糖化酶添加量及糖化時間這4個顯著影響因素，采用響應面分析法優化了小米綠豆的糖化工藝，最優條件為α-淀粉酶添加量307 U/g、液化溫度80 ℃、液化時間39 min、糖化酶添加量1700 U/g、糖化溫度60 ℃、糖化時間61.5 min、加水量為原料的400%、蛋白酶添加量300 U/g以及高粱添加量15%。在此條件下，得到的小米綠豆糖化醪氨基酸態氮含量為0.127 g/dL，還原糖含量為12.85 g/dL，總黃酮含量為156.14 mg/dL，綜合評分為87.32分。