響應面法優化雙水相萃取沙蔥中總黃酮的工藝條件

呂博威，王翠芳，霍紅雁，郭佳星，張繼星，張智勇，倪娜*

(1.內蒙古民族大學 生命科學與食品學院，內蒙古 通遼 028000；2.通遼市農業科學研究院，內蒙古 通遼 028015)

沙蔥(AlliummongolicumRegel)為百合科(Liliaceae)蔥屬(Allium)植物，廣泛分布于我國內蒙古、甘肅、陜西等地的草原、荒漠或干旱地帶。沙蔥具有較強的抗病性和適應性，易栽培，在荒漠地區具有重要的生態價值[1]。目前，學術界關于沙蔥的研究主要集中于沙蔥的育種與栽培[2-4]、組織培養[5]、營養價值和飼用價值開發[6-7]、有效成分提取[8]等方面。沙蔥作為一種營養豐富、風味鮮爽的地方特色蔬菜，深受北方消費者喜愛，在甘肅、內蒙地區已形成了多個沙蔥種植基地。目前，沙蔥的食用方式主要以鮮食為主，包括清炒、涼拌、拌餡兒、涮食等，因其獨特的風味，還可制成腌沙蔥、沙蔥醬、下飯菜等調味品。

黃酮類化合物存在于所有維管植物的葉、根、莖、花和果實中，又稱黃酮體、黃堿素，是植物的次生代謝產物[9]。黃酮類化合物具有抗炎、抗菌、抗氧化、抗過敏、抗腫瘤、保護心腦血管和殺蟲等多種生理生化活性[10-12]。作為沙蔥的主要活性成分之一，黃酮在制備沙蔥源功能性調味品方面起重要作用，沙蔥中黃酮類化合物的研究尤為重要。植物中提取總黃酮的方法多采用乙醇浸提法、超聲法和微波法，然而這些方法或浸提時間長,或提取率低,或生產造價高，均不適于規模化生產。同時，超聲提取易造成分子中C-C雙鍵斷裂，導致化合物不穩定，而微波法由于設備的安全性問題可能對健康造成不利影響[13]，因此新型黃酮提取技術倍受人們關注[14]。研究表明親水性有機物的水溶液在一定條件下可形成雙水相，雙水相萃取技術可以實現雙相中物質的提取和分離[15]，具有提取率高,易于放大生產,對操作環境要求較低,可連續性操作,綠色環保等優點，在植物活性成分提取上具有較大的應用潛力。張麗等[16]采用聚乙二醇(PEG)/(NH4)2SO4雙水相體系萃取分離了紅高粱色素，優化后的萃取率可達98.25%。曹小燕等[17]利用超聲輔助乙醇-硫酸銨雙水相法分離了油菜籽粕黃酮，其平均提取量為(5.53±0.03) mg/g。采用雙水相體系提取沙蔥總黃酮的研究尚未見報道。

本文以乙醇-K2HPO4雙水相體系為基礎探究沙蔥總黃酮的萃取條件，采用響應面法優化主要工藝參數以提高黃酮萃取率，為沙蔥的綜合利用和總黃酮的產量提供了理論依據，為研發營養型調味品提供了理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

沙蔥干粉：實驗室自制；無水乙醇、蘆丁標準品、K2HPO4、NaOH、Al(NO3)3、NaNO2等：均為分析純試劑。

UV-5500PC紫外可見分光光度計 上海元析儀器有限公司。

1.2 雙水相相圖繪制

利用Albertsson[18]的濁點滴定法測定雙水相體系的組成，并繪制雙水相相圖。稱取定量K2HPO4(ms)溶于去離子水(mw)中，利用滴定管緩慢滴加無水乙醇并振蕩，直至溶液出現渾濁，記錄滴加的乙醇質量(mei)，記錄此時體系總質量(mi)。加入適量去離子水(mwj)，使溶液澄清，記錄此時體系總質量(mj)。再次向錐形瓶中滴加無水乙醇，直至再次達到渾濁，如此反復操作，記錄每次達到渾濁時乙醇和K2HPO4在系統中所占的質量分數，計算公式如下：

以乙醇質量分數為縱坐標，K2HPO4質量分數為橫坐標作圖，即可得一條雙節線的相圖。

1.3 黃酮含量測定方法

參考郭磊等[19]、王梅霖等[20]的方法并略作修改。精密稱取蘆丁標準品10.4 mg以95%乙醇定容，標準液濃度為0.416 mg/mL。精密量取0.0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL蘆丁標準液，分別加入5% NaNO2溶液0.3 mL，靜置6 min；加入0.3 mL 10%的Al(NO3)3溶液，靜置6 min后加入4 mL NaOH溶液，用蒸餾水補齊至10 mL，充分振蕩后靜置3 min，測定吸光值(A508 nm)。以蘆丁標準液濃度(mg/mL)為橫坐標，以A508 nm為縱坐標，繪制標準曲線，其回歸方程為C=0.8848A-0.0052，R2=0.9926，表明0.000～0.416 mg/mL范圍內線性關系良好。依據標準曲線計算待測液中的黃酮含量。

1.4 沙蔥黃酮粗提液的制備及含量測定

1.4.1 粗提液制備

沙蔥黃酮的粗提方法參考薩茹麗[21]的方法并略作修改。沙蔥干粉中按1∶10(g/mL)的比例加入石油醚進行脫脂、脫色處理，待石油醚全部揮發后，按1∶25(g/mL)的比例加入75%乙醇后超聲處理15 min，真空抽濾去殘渣，濾液定容后于4 ℃冷藏。

1.4.2 雙水相萃取

上述樣品中按試驗設計要求加入K2HPO4、無水乙醇和蒸餾水，充分振蕩均勻后放入分液漏斗靜置，達到相分離。

1.4.3 黃酮萃取率計算

在1.4.2中的雙水相體系上下相分離并稱量體積，用1.3中所述方法測量上下相液體的黃酮含量并進行計算，公式如下：

式中：m1為上相液體黃酮含量，mg；m2為下相液體黃酮含量，mg。

1.5 雙水相萃取單因素試驗

1.5.1 乙醇質量分數

雙水相體系中乙醇質量分數分別設置為10%、15%、20%、25%、30%、35%，固定沙蔥粗提液質量分數為20%，K2HPO4質量分數為30%。

1.5.2 K2HPO4質量分數

將雙水相體系中K2HPO4質量分數分別設置為10%、15%、20%、25%、30%、35%，固定乙醇質量分數為20%，沙蔥粗提液質量分數為20%。

1.5.3 沙蔥粗提液質量分數

將雙水相體系中沙蔥粗提液質量分數分別設置為10%、14%、18%、22%、26%、30%，固定乙醇質量分數為20%，K2HPO4質量分數為30%。

1.6 響應面法優化

在單因素試驗方案的基礎上，利用Box-Behnken響應面設計優化黃酮提取工藝條件。以黃酮萃取率為響應值，以乙醇質量分數、K2HPO4質量分數和沙蔥粗提液質量分數3個因素為自變量，各因素設置3個水平，水平編碼見表1。

表1 響應面試驗因素和水平Table 1 The factors and levels of response surface test

1.7 數據分析

利用Origin 2019繪圖，并運用Design Expert 11軟件對數據進行分析、優化、模型建立與檢驗。

2 結果與分析

2.1 雙水相相圖

乙醇-K2HPO4雙水相相圖見圖1，以曲線為界，下方為單相區，上方為兩相區。當選取偏離臨界點(即曲線上的點)的適宜數值時，易于形成雙水相體系[22]。通過調整乙醇、水和K2HPO4的添加量同時記錄上下相質量的變化發現：固定乙醇質量時，下相體積隨著K2HPO4添加量的增多而增大，直至飽和；而固定乙醇和鹽的質量時，水必須維持在適宜的范圍內，否則將不能形成雙水相或過早進入飽和狀態；當K2HPO4溶液質量被固定時，加入過量的乙醇會造成K2HPO4無法溶解，過少則不能形成雙水相。

圖1 雙水相相圖Fig.1 Aqueous two-phase system diagram

2.2 單因素試驗

2.2.1 乙醇質量分數

乙醇質量分數對黃酮萃取率的影響見圖2。

圖2 乙醇質量分數對沙蔥總黃酮萃取率的影響Fig.2 Effect of ethanol mass fraction on the extraction rate of total flavonoids from Allium mongolicum Regel

由圖2可知，當乙醇質量分數低于20%時，隨著乙醇質量分數的增加，沙蔥中總黃酮的萃取率逐漸升高，當乙醇質量分數達到20%時，萃取率達到峰值，而后乙醇質量分數繼續增加時萃取率下降。這是因為黃酮苷具有親水作用，乙醇作為一種極性溶液，過高或過低濃度的乙醇不利于沙蔥總黃酮的溶解[23]。當乙醇濃度較低(低于20%)時，隨著上相中乙醇質量的增加，體系分相能力也逐漸增強，而黃酮在乙醇中的溶解度較在水中時大，因此其萃取率增加；而當乙醇質量分數過高(大于20%)時，溶液的極性降低，而此時其他有機物的溶出量增加，從而抑制了黃酮的萃取。因此，乙醇的最佳質量分數選擇20%。

2.2.2 K2HPO4質量分數

由圖3可知，當乙醇濃度和沙蔥粗提液濃度一定時，黃酮的萃取率隨著K2HPO4質量分數的增加而升高，當K2HPO4質量分數達到25%時，黃酮萃取率最高，而后萃取率隨之下降。分析其萃取率下降的原因可能是出現了鹽溶液過飽和現象。雙水相體系中無機鹽類物質的添加可以改變兩相中成相物質的組成，當加入K2HPO4質量過多時，雙水相體系中鹽溶液過飽和導致鹽析現象的出現，沙蔥黃酮隨著鹽從體系中一起沉淀出來，從而導致黃酮萃取率下降。

圖3 K2HPO4質量分數對沙蔥總黃酮萃取率的影響Fig.3 Effect of K2HPO4 mass fraction on the extraction rate of total flavonoids from Allium mongolicum Regel

2.2.3 沙蔥溶液質量分數

由圖4可知，在乙醇和K2HPO4質量分數一定時，黃酮萃取率隨著沙蔥粗提液質量分數的增加而升高，當沙蔥粗提液質量分數達到18%時，黃酮萃取率達到最大值，而后繼續添加粗提液時黃酮萃取率基本保持不變。從節約材料方面考慮，確定最佳沙蔥粗提液質量分數為18%。

圖4 沙蔥粗提液質量分數對沙蔥總黃酮萃取率的影響Fig.4 Effect of the mass fraction of Allium mongolicum Regel crude extracts on the extraction rate of total flavonoids from Allium mongolicum Regel

2.3 響應面法優化及分析

2.3.1 響應面法優化設計及結果

運用Design-Expert 8.0軟件的Box-Behnken試驗設計方案，在乙醇-K2HPO4雙水相體系的基礎上，對乙醇質量分數(A)、K2HPO4質量分數(B)、沙蔥粗提液質量分數(C)設計三因素三水平試驗，方案及結果見表2。

表2 試驗設計與結果Table 2 The test design and results

續 表

2.3.2 模型擬合

以總黃酮萃取率(R1)為響應值，得到回歸方程R1=97.40+3.65A+2.60B+0.68C-1.96AB +0.97AC-0.33BC-4.63A2-4.93B2-2.85C2，并進行方差分析，見表3。

表3 方差分析Table 3 The analysis of variance

該模型顯著性良好(P<0.01)，失擬項的P=0.107>0.05，不顯著，說明該模型成立。R2用來代表回歸方程的可靠性，R2值越接近1，方程的可靠性越高，該模型的回歸方程的決定系數R2=0.9898，校正決定系數RAdj2=0.9766，R2和RAdj2數值較高且接近，說明模型具有較高的準確性和通用性，變異系數值C.V.=0.88%<10.00%，可以用此回歸方程來預測沙蔥總黃酮的最佳萃取工藝條件。模型的交互項AC、BC差異不顯著(P>0.05)，一次項C、交互項AB、二次項C2對沙蔥總黃酮萃取量具有顯著影響(P<0.05)，一次項A、B以及二次項A2、B2對沙蔥總黃酮萃取量均有極顯著的影響(P<0.01)。通過F值可以看出各因素對沙蔥總黃酮萃取率的影響程度，其順序依次為：乙醇質量分數(A)>K2HPO4質量分數(B)>沙蔥粗提液質量分數(C)。

2.3.3 響應面圖分析

乙醇質量分數和K2HPO4質量分數、乙醇質量分數和沙蔥粗提液質量分數、K2HPO4質量分數和沙蔥粗提液質量分數對沙蔥總黃酮萃取率的交互影響見圖5～圖7。由圖可以直觀地看出沙蔥總黃酮萃取率在試驗范圍內都有最大值，說明因素水平選擇范圍合理，趨勢明朗，能明顯反映出各因素對沙蔥總黃酮萃取率的影響[24-25]。響應面曲線中，等高線為圓形表示因素之間的交互作用不強，為鞍形或橢圓形則表示因素之間的交互作用較強[26]。

由圖5～圖7可知，在交互作用的影響下，沙蔥總黃酮萃取率的變化趨勢相似，即先增加后減少。由圖5可知，乙醇質量分數和K2HPO4質量分數的交互作用對沙蔥總黃酮萃取率存在顯著影響。圖6中交互作用對萃取率的影響與圖5相似，隨著乙醇質量分數和沙蔥粗提液質量分數的增加，總黃酮萃取率呈先增加后減少的趨勢，乙醇質量分數對其影響更大，表現為響應曲面更為陡峭，等高曲線更為密集[27]。由圖7可知，K2HPO4質量分數和沙蔥粗提液質量分數的交互作用對沙蔥總黃酮萃取率的影響不顯著，這與表3中的P值分析一致。

2.3.4 最佳提取條件的確定及驗證

通過軟件對二次多項式回歸方程進行分析預測，沙蔥-K2HPO4雙水相萃取沙蔥總黃酮最佳工藝條件為乙醇質量分數23.68%，K2HPO4質量分數25.93%，沙蔥粗提液質量分數19.79%。結合實際操作情況，將其最佳工藝條件修正為乙醇質量分數24%，K2HPO4溶液質量分數26%，沙蔥粗提液質量分數20%，在此條件下對建立的模型開展驗證試驗，設置3組平行試驗，獲得的沙蔥總黃酮實際萃取率為(98.13±0.20)%，理論預測值為98.36%，預測誤差不足1%，證實了預測模型準確可靠，具有實際應用價值。

3 結論

采用乙醇-K2HPO4雙水相體系萃取沙蔥總黃酮，先后利用了單因素試驗和響應曲面分析構建了沙蔥總黃酮萃取率與萃取條件的二次多項式模型，得到了沙蔥黃酮的最佳萃取參數，同時驗證試驗表明該模型擬合度較好。雙水相法萃取沙蔥總黃酮的最佳工藝條件為：乙醇質量分數24%，K2HPO4質量分數26%，沙蔥粗提液質量分數20%，總黃酮萃取率可達(98.13±0.20)%。雙水相萃取法具有萃取率高、成本低廉、簡單易行、綠色安全等優勢，作為高效萃取沙蔥總黃酮的新方法，可為實際生產提供理論依據。