豌豆多肽-亞鐵螯合物制備工藝優化及抗氧化研究

尹樂斌，何平，李樂樂，劉椏麗，楊學為，羅雪韻

(1.邵陽學院 食品與化學工程學院，湖南 邵陽 422000；2.豆制品加工與安全控制湖南省重點實驗室，湖南 邵陽 422000)

豌豆(PisumsativumL.)是一種組成比較平衡優良的植物蛋白資源[1]，不含植物性雌性激素等優點，豌豆蛋白占干重的23%～25%[2]。目前，已知豌豆蛋白含有3種過敏原[3]，食用后可能造成體內酸堿失衡、腹瀉、貧血甚至出現神志不清、休克等不良反應，影響豌豆蛋白的應用領域，人們常采用酶解法[4]改變過敏原的線性或構象表位制備豌豆多肽，開發低過敏原的豌豆蛋白。豌豆多肽富含人體必需氨基酸[5]，具備易消化吸收、穩定性強、促進腸道有益菌生長[6]等優點，可作為恢復期患者和消化功能低下的老年人的輔助營養物質，也可加入到各類調味品的調制中[7]。作為食品原料，豌豆多肽比豌豆蛋白具有更廣泛的應用前景。因此，對豌豆多肽進行開發和研究具有一定的價值。

鐵是機體必不可少的微量元素。當體內缺鐵時，會造成貧血，影響兒童生長、智力和運動的發育[8]。而傳統鐵補充劑中，一代補鐵劑硫酸亞鐵因釋放鐵離子快速引起惡心、嘔吐等不良反應[9]，二代可溶性小分子有機酸-鐵鹽螯合物具有成本高[10]、二價鐵離子易不穩定等缺點。因此，尋找新型鐵補充劑是目前的研究熱點。當前，食源性有機肽-亞鐵螯合物可以維持鐵以亞鐵離子的形式被人體吸收，同時具有成本低、能耗低、無毒副作用等優點，是一種理想的鐵補充劑。畢秋蕓[11]將裙帶菜多肽與亞鐵離子螯合制備裙帶菜多肽-亞鐵螯合物，肖懷秋等[12]將花生肽與亞鐵螯合制備花生多肽-亞鐵螯合物，均擴大了人體鐵補充劑的來源，豐富了補充劑的種類。本研究對豌豆多肽與亞鐵離子螯合制備螯合物工藝進行優化，并測得最佳工藝條件下豌豆多肽-亞鐵螯合物的抗氧化活性，為豌豆蛋白質資源的充分利用以及拓寬鐵補充劑的來源提供了技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豌豆蛋白：實驗室提取所得；堿性蛋白酶(200000 U/g)：四川合氏生物科技有限公司；抗壞血酸(分析純)：西隴科學股份有限公司；氯化亞鐵(分析純)：天津市大茂化學試劑廠；1,10-菲啰啉(一水合物，分析純)：國藥集團化學試劑有限公司；ABTS(2,2′-聯氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸，純度>98.0%)：合肥巴斯夫生物科技有限公司；DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼，純度>97.0%)：上海如吉生物科技有限公司。

1.2 主要儀器與設備

雙列四孔恒溫水浴鍋 北京中興偉業儀器有限公司；3H16RI臺式高速冷凍離心機 湖南赫西儀器裝備有限公司；D-7紫外可見分光光度計 南京菲勒儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 亞鐵離子濃度標準曲線的制作

參考魏冬梅等[13]的方法并進行適當調整。取0.4 mL樣品，加入pH為4.6的醋酸-醋酸鈉緩沖液1 mL、1%鹽酸羥胺0.5 mL、0.1%鄰菲啰啉1 mL，定容至10 mL。采用紫外分光光度計在440～600 nm處進行掃描，確定最佳測定波長以及最佳反應時間。

標準曲線的繪制：用莫爾鹽(硫酸亞鐵銨Fe(NH4)2·(SO4)2·6H2O)配制不同濃度的亞鐵離子溶液，分別加入緩沖液顯色劑，反應一段時間后，于最佳測定波長處測定吸光度，最后繪制相關性標準曲線(亞鐵離子濃度與吸光度)。

1.3.2 豌豆多肽的制備

運用堿沉淀法[14]提取得到豌豆蛋白，稱取豌豆蛋白7.2 g，配制7.2%豌豆乳，調節pH為12，加入0.42 g堿性蛋白酶，50.5 ℃酶解2.8 h，得到豌豆蛋白酶解液，超濾得到豌豆多肽(分子量<800 Da)。

1.3.3 豌豆多肽-亞鐵螯合物的制備

稱取1.500，1.875，2.250，2.625，3.000 g豌豆多肽并加入50 mL水于錐形瓶中，調節溶液pH為6.5，添加抗壞血酸0.075，0.150，0.225，0.300，0.375 g、氯化亞鐵1.5 g，在溫度20，25，30，35，40 ℃恒溫螯合40，50，60，70，80 min，得到螯合后的樣品。

根據單因素優化試驗結果，將A螯合時間、B抗壞血酸添加量、C螯合溫度、D多肽添加量作為自變量，設置低(-1)、中(0)、高(1)3個水平，以豌豆多肽與亞鐵螯合率為響應值，進行響應面試驗。通過Design-Expert軟件預測制備豌豆多肽-亞鐵螯合物的最佳工藝，最后進行驗證試驗。響應面因素與水平表見表1。

表1 響應面分析法的因素與水平表

1.3.4 樣品螯合率的測定

將螯合后的樣品離心(10000 r/min，10 min)，棄去上清液，加入10 mL無水乙醇洗滌，離心(10000 r/min，10 min)，得沉淀豌豆多肽-亞鐵螯合物，加入10 mL 2 mol/L鹽酸溶液水解，離心(10000 r/min，10 min)，得到含有亞鐵離子的上清液，采用鄰菲啰啉比色法測定亞鐵離子含量，通過下式計算得到多肽與亞鐵離子的螯合率。

式中：m1為螯合物中亞鐵離子含量，g；m2為加入螯合體系的亞鐵離子含量，g。

1.3.5 抗氧化活性

通過測定ABTS[15]、DPPH[16]自由基清除率來評價豌豆多肽-亞鐵螯合物的抗氧化活性。

1.4 試驗數據處理

試驗每組重復3次，用WPS Office、SPSS、Design-Expert V8.0.6.1等軟件進行誤差分析、繪圖、方差分析、響應面優化等數據分析。

2 結果與分析

2.1 鄰菲啰啉法亞鐵離子標準曲線

采用鄰菲羅啉法測定亞鐵離子濃度，在波長440～600 nm處的掃描圖見圖1，發現測定波長為510 nm時，與空白樣相比，樣品的吸光度最大；反應時間對吸光度的影響見圖2，當樣品與顯色劑反應達到20 min后，增大反應時間，樣品的吸光度變化不大，因此，選取測定波長510 nm、反應時間20 min進行后續試驗。

圖1 樣品的光譜掃描Fig.1 The spectral scanning of the sample

圖2 不同反應時間下樣品吸光度Fig.2 The absorbance of sample at different reaction time

經過試驗得到亞鐵離子濃度的標準曲線，見圖3。

圖3 亞鐵離子濃度標準曲線Fig.3 The standard curve of ferrous ion concentration

由圖3可知，溶液濃度與吸光度呈正相關，得到方程式：A=8.221x-0.0013，其中相關系數R2=0.9999，較好，可用來模擬鐵離子濃度與吸光度的關系。

2.2 豌豆多肽與氯化亞鐵制備豌豆多肽-亞鐵單因素試驗

螯合時間對豌豆多肽-亞鐵螯合率的影響見圖4。

由圖4可知，隨著螯合時間延長，豌豆多肽與亞鐵離子的螯合率增大，可能是螯合時間過短，反應不充分。超過最佳螯合時間70 min后，由于體系pH值變化或螯合物穩定性降低而導致螯合物的結構不穩定，亞鐵離子被釋放到多肽結構外部成為游離狀態，從而降低其螯合率[17]。因此,選擇螯合時間70 min進行后續試驗。

圖4 螯合時間對豌豆多肽-亞鐵螯合率的影響Fig.4 The effect of chelation time on pea polypeptide-ferrous chelation rate

抗壞血酸添加量對豌豆多肽-亞鐵螯合率的影響見圖5。

圖5 抗壞血酸添加量對豌豆多肽-亞鐵螯合率的影響Fig.5 The effect of ascorbic acid additive amount on pea polypeptide-ferrous chelation rate

抗壞血酸主要用來發揮抗氧化性，使亞鐵離子(Fe2+)避免被氧化為三價鐵離子(Fe3+)[18]。由圖5可知，當抗壞血酸濃度較低(低于0.225 g)時，無法保證鐵以亞鐵的形式存在，所以螯合率低。當體系中抗壞血酸含量過量時，反應體系的酸堿值遭到破壞，造成螯合率略有下降[19]。最佳抗壞血酸添加量為0.225 g。

螯合溫度對豌豆多肽-亞鐵螯合率的影響見圖6。

圖6 螯合溫度對豌豆多肽-亞鐵螯合率的影響Fig.6 The effect of chelation temperature on peapolypeptide-ferrous chelation rate

由圖6可知，隨著溫度的上升，多肽分子結構進一步舒展，同時分子和離子間的熱運動加劇，促進整個螯合反應的進行[20]。而當溫度進一步升高超過30 ℃時，抗壞血酸被破壞，無法維持亞鐵離子價態的穩定，導致Fe2+被氧化為Fe3+，螯合率下降。豌豆多肽與亞鐵離子螯合是放熱反應，溫度過高會抑制反應的進行，還會促進亞鐵離子氧化水解生成Fe(OH)3沉淀，螯合率下降[21]。因此,選擇螯合溫度30 ℃進行后續試驗。

豌豆多肽添加量對豌豆多肽-亞鐵螯合率的影響見圖7。

圖7 豌豆多肽添加量對豌豆多肽-亞鐵螯合率的影響 Fig.7 The effect of pea polypeptide additive amount polypeptide-ferrous chelationrate on pea

豌豆多肽結合亞鐵離子的數量是一定的，當反應體系中多肽含量較低時，螯合物的環狀結構極其不穩定，影響螯合率[22]。由圖7可知，當豌豆多肽含量超過2.625 g時，氯化亞鐵結合的位點有限，會造成多肽的浪費[23]。所以,螯合最佳豌豆多肽添加量為2.625 g。

2.3 豌豆多肽與氯化亞鐵制備豌豆多肽-亞鐵響應面優化試驗

在單因素試驗的基礎上進行響應面分析，響應面方案及試驗結果見表2。

表2 響應面分析方案及試驗結果Table 2 Response surface analysis scheme and experimental results

續 表

4個單因素經過回歸擬合后，得到豌豆多肽、Fe2+制備豌豆多肽-Fe2+螯合物工藝條件的二次項回歸方程：

螯合率(%)=+31.17+1.19A+1.26B-1.52C+1.26D+1.63AB-1.26AC-1.61AD+1.83BC-2.02BD+1.42CD-4.30A2-2.05B2-2.06C2-1.37D2。

根據響應面試驗結果，得出螯合率方差分析表，見表3。

表3 螯合率方差分析表Table 3 Analysis of variance of chelation rate

由表3可知，試驗模型的P<0.0001，表明模型與回歸方程顯著；螯合率的失擬項P=0.8421，不顯著(P>0.05)，相關系數R2=0.9125，校正系數RAdj2=0.825，說明回歸方程與實際擬合度較好，響應面的預測值與本次試驗測得的具體值聯系緊密，試驗誤差小，本模型適用于預測不同螯合條件下豌豆多肽-亞鐵螯合率；由F值可知，各因素對豌豆多肽-亞鐵螯合率的影響順序為C螯合溫度>B抗壞血酸添加量>D多肽添加量>A螯合時間。

經軟件分析結合實際生產情況進行驗證試驗，該模型得到的豌豆多肽-亞鐵螯合物最佳條件為螯合時間72.72 min、抗壞血酸添加量0.25 g、螯合溫度28.2 ℃、多肽添加量2.58 g，螯合率為31.394%，與預測值差異不顯著(P>0.05)。

2.4 抗氧化活性

由圖8可知，在0～0.16 mg/mL范圍內，隨著豌豆多肽-亞鐵螯合物質量濃度的增加，ABTS自由基的清除率增加，0.16 mg/mL時清除率約為100%。

圖8 不同樣品對ABTS自由基清除率Fig.8 The scavenging rate of ABTS free radicals by different samples

由圖9可知，豌豆多肽-亞鐵螯合物質量濃度在0～0.64 mg/mL范圍內對DPPH自由基的清除率不斷增加，之后趨于穩定。綜上所述，豌豆多肽-亞鐵螯合物對ABTS自由基、DPPH自由基具有較好的清除效果。幾種不同樣品的抗氧化活性能力為：Vc(維生素C)>亞鐵離子>豌豆多肽-亞鐵螯合物>豌豆多肽，說明螯合物將兩個原料較好地結合在一起共同發揮清除活性，與馬利華[24]的實驗結果相似。經過計算得到豌豆多肽-亞鐵螯合物對ABTS自由基、DPPH自由基的EC50(半數清除率)分別為0.084，0.268 mg/mL。

圖9 不同樣品對DPPH自由基清除率Fig.9 The scavenging rate of DPPH free radicals by different samples

3 結論

通過將豌豆多肽與亞鐵離子進行螯合工藝優化得到最佳螯合條件：螯合時間72.72 min、抗壞血酸添加量0.25 g、螯合溫度28.2 ℃、多肽添加量2.58 g，此時制備豌豆多肽-亞鐵螯合率為31.394%。對亞鐵離子、豌豆多肽、豌豆多肽-亞鐵螯合物、Vc進行ABTS、DPPH自由基清除率比較，發現螯合物的抗氧化活性較原豌豆多肽有所提高，且具有較好的抗氧化活性。與李文軍等[25]的實驗結果類似，證明大豆多肽鐵螯合物具備抗氧化性，有較高的生物活性，是優質的鐵補充劑。將鐵與多肽螯合研究新型貯鐵方法，有利于挖掘其在食品調味品、添加劑、保健食品等方面的潛力，擴大其應用前景。但目前對螯合物的螯合機制以及體外模擬口腔、胃、腸仍處于初級階段，因此后續可對螯合物的結構進行表征探究螯合機理，對樣品進行動物模擬消化研究。