大豆根際土壤產ACC脫氨酶細菌的分離與鑒定

黃天姿，李同祥*，湯 薇，孫會剛，王繼良

（1.徐州工程學院食品與生物工程學院，江蘇徐州 221018；2.廊坊農林科學院，河北廊坊 065000）

豆科植物具有十分廣闊的應用空間，可將其用作生物飼料、植物肥料和土地覆蓋種植物［1］。豆類農作物可生長在世界各地的各種氣候帶、各種地形和各種土壤中［2］。農耕土壤中，尤其是作物根際土壤，存在著豐富的、生理活動活躍的多種微生物群落。這些微生物可與植物根系相互作用，影響植物的代謝，其中一類可促進植物生長的根際細菌統稱為植物根際促生細菌（Plant Growth-Promoting Rhizobacteria，PGPR）［3］。在PGPR 中，部分細菌能夠利用其自身產生的1-氨基環丙烷-1-羧基（ACC）脫氨酶，降低宿主植物根系和植物體內的ACC 水平并減少乙烯的產生，進而減弱由乙烯介導的對宿主植物生長的抑制作用，削弱逆境脅迫對宿主植物造成的傷害，促進宿主植物的生長［4］。因此，可以產生ACC 脫氨酶的細菌備受學者關注，并且被認為在干旱、鹽堿地、農藥污染和重金屬污染等逆境脅迫條件下能有效促進宿主植物生長，是具有廣泛應用潛力的一類PGPR［5］。

為篩選能產生ACC 脫氨酶活性的大豆根際土壤細菌，通過菌落形態、生理生化、16S rDNA 基因測序，鑒定了分離得到的5 株活性菌株，并測定了5 個菌株的ACC 脫氨酶活性，豐富了大豆根際土壤產ACC 脫氨酶的細菌資源，對進一步研究大豆促生的菌種資源具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

大豆根際土壤（江蘇省食品安全生物芯片檢測技術工程實驗室所屬實驗田地取樣，土質優良，大豆長勢較好），保存于實驗室。實驗用LB、TSB、DF 及ADF 培養基均為市售。

1.2 實驗方法

1.2.1 細菌的分離及純化

精確稱取1 g 土壤，無菌水定容至100 mL，混勻備用。大豆土壤液按10 倍梯度稀釋至10-8，吸取100 μL 稀釋液于LB（TSB）培養基上，涂抹均勻，于37 ℃培養箱中培養；觀察菌落形態。將上述菌落形態各不相同的菌株，挑出單菌落，分別劃線于LB 培養基中，37 ℃下培養24 h。分別劃線并重復操作3 次以上，最終劃線出其單菌落菌株，編號后置于-20 ℃冰箱保藏。

1.2.2 ACC 脫氨酶活性菌株的篩選

1）初篩。將分離出的菌株接種于DF、ADF 培養基（以ACC 作為唯一氮源），37 ℃培養24～72 h，觀察菌株生長狀況。若菌株可以生長，說明成功篩選出可降解ACC 菌株，若沒有生長則表明此菌株無ACC 活性。

2）ACC 脫氨酶活性測定。以每分鐘ACC 脫氨酶催化ACC 生成1 μmol α-丁酮酸所需的酶量表示ACC 脫氨酶單位酶活［6］。通過Bradford 比色法測定酶蛋白含量。單位酶活力（U）與總蛋白質量（mg）的比值為比活力，表示活性菌株的ACC 脫氨酶活性（U·mg-1）。ACC 脫氨酶活性計算公式如（1）所示。

1.2.3 ACC 脫氨酶活性菌株的鑒定

1）生理生化鑒定。菌株形態和培養特征觀察［7］。

2）16S rDNA 鑒定。提取5 株ACC 酶活性菌株總DNA，16S rDNA PCR 擴增，擴增產物經電泳檢測后送至生工生物工程有限公司進行測序，構建系統進化樹并進行分析。

2 結果與分析

2.1 根際細菌的分離和純化

通過細菌培養基，篩選出10 株根際細菌，編號H1～H10，菌落形態特征見表1。從表1 可以看出，細菌的形態大小不盡相同，菌落大多呈圓形、乳黃色，有些菌落表面干燥，有些表面圓滑，分布形式密集與疏散的菌落數量大體相當。

表1 根際細菌菌落形態特征

2.2 具有ACC 脫氨酶活性菌株篩選

從大豆根際土壤分離出的10 株細菌中，以ACC作為唯一氮源的DF、ADF 培養基篩選出5 株具有ACC 脫氨酶活性的菌株，菌株形態特征見圖1，ACC脫氨酶活性見表2。從表2 數據可知，H9 的ACC 脫氨酶活性最大，H2 的最小，H9 的活性約為H2 的7 倍。

圖1 H1、H2、H8、H9、H10 菌落形態

表2 5 株活性菌株的ACC 脫氨酶活性

2.3 活性菌株的鑒定

5 株活性菌株生理生化反應結果如表3 所示，基因組鑒定結果如圖3 所示。結合菌落形態、生理生化及16S rDNA 序列測定，確定H1 為地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis），H2 為蘇云金桿菌（Bacillus thuringiensis），H8 為貝萊斯芽胞桿菌（Bacillus velezensis），H9 為芽孢桿菌屬細菌（Bacillussp.），H10 為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）。

圖3 基于16S rDNA 基因序列構建菌株系統進化樹

表3 5 株活性菌株生理生化反應

3 結論與討論

從大豆根際土壤中分離得到10 株根際細菌，從10株菌株中篩選出5 株能以ACC 作為唯一氮源的細菌。通過菌落形態、生理生化及16S rDNA 測序得出H1 為地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis），H2 為蘇云金桿菌（Bacillus thuringiensis），H8為貝萊斯芽胞桿菌（Bacillus velezensis），H9 為芽孢桿菌屬（Bacillussp.），H10 為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）；檢測了這5 株細菌的ACC 脫氨酶活力，其中H9 的ACC 脫氨酶活性最大，為0.097 8 U·mg-1，H2 的ACC 脫氨酶活性最小，為0.013 3 U·mg-1。

具有ACC 脫氨酶活性的微生物已被證明能在一定程度上減輕環境脅迫對植物的傷害［8］。趙龍飛等在大豆根瘤中篩選出8 株具有ACC 脫氨酶活性內生細菌，活性最高的菌株（DD132）的酶活為15.712 U·mg-1［9］。和DD132 相比，本實驗從大豆根際土壤中分出的5 株ACC 脫氨酶活性菌株活性低很多（活性最大的H9 僅為0.097 8 U·mg-1），可能與菌株的取樣環境不同有關（DD132 是從大豆根瘤中篩選，而H9 存在大豆根際土壤中）。