基于同源雙交換的聚球藻PCC 7942基因組大片段無標記刪除

柯竹芳 徐旭東 高 宏

(1. 中國科學院水生生物研究所中國科學院藻類生物學重點實驗室, 武漢 430072; 2. 中國科學院大學, 北京 100049)

藍藻是一類具植物型放氧光合系統的原核生物, 被廣泛用于光合作用[1]、原核細胞分化和圖式形成[2]、固氮作用和晝夜節律[3]等研究。同時, 藍藻還可能作為微藻細胞工廠, 合成多種天然活性物質和工業化學品, 極具開發利用潛力[4]。在藍藻合成生物學中, 基因組簡化有利于提高底盤基因組的可控性和可預測性, 避免無關基因的干擾, 為藍藻合成生物學的研究和應用提供一個優化的底盤細胞。通過自上而下的基因組簡化是構建底盤細胞的重要途徑[5], 借助基因組編輯技術刪除冗余序列可以獲取基因組簡化藻株。若是對基因組中非必需基因逐個地刪除, 工作量大且耗時久。因此, 發展高效的大片段無標記刪除技術是基因組簡化的關鍵。無標記遺傳操作技術在大腸桿菌和枯草芽孢桿菌基因組簡化研究中已取得較大的進展[6—9],而藍藻基因組簡化的研究發展相對較晚, 在藍藻細胞中開發基因組大片段無標記刪除技術進行基因組簡化對于構建高效的合成生物學平臺很有必要。理論上, 傳統的同源重組技術可以用于無標記的基因刪除, 但是應用此技術在藍藻中進行大片段的無標記刪除目前尚沒有報道。為此, 本研究嘗試使用傳統的同源重組和篩選技術刪除藍藻中的大片段, 為進一步開展基因組簡化研究打下基礎。

聚球藻(Synechococcus elongatus)PCC 7942是一種單細胞淡水藍藻, 最早被稱為Anacystis nidulansR2, 也是最早發現可以進行自然轉化的藍藻[10],實際上也可以通過接合轉移開展遺傳操作。由于生長快速、結構簡單和具有高效的遺傳操作系統[11—13]等特點, 是研究光合作用和晝夜節律的重要模式生物, 并且正被開發為用作生產可再生燃料、化學品和藥物的細胞工廠。2015年, Rubin等[14]完成對聚球藻PCC 7942全基因組的飽和誘變, 利用轉座插入突變和測序方法, 發現其基因組的2723個基因中有1748個為非必需基因。聚球藻PCC 7942基因組中的非必需基因的確定為我們進行大片段刪除提供了重要信息。本研究以聚球藻PCC 7942基因組中3個大于10 kb的非必需區域的無標記刪除為例, 證明利用傳統技術在藍藻中進行無標記刪除大片段的可行性。

1 材料與方法

1.1 菌株(藻株)、質粒和培養條件

聚球藻PCC 7942系中國科學院青島生物能源與過程研究所呂雪峰實驗室提供, 在30℃, 30 μE/(m2·s)連續光照條件下以BG11液體培養基靜置培養。通過測定OD730來檢測藻株生長情況, 待藻細胞生長達到對數期時用于各項實驗。E. coliDH5a、E.coliHB101在37℃以LB振搖培養。含有質粒的大腸桿菌根據其攜帶的抗性基因補加相應抗生素: 50 μg/mL壯觀霉素 (Sp)、100 μg/mL氨芐青霉素 (Ap) 或10 μg/mL四環素(Tc)、20 μg/mL氯霉素 (Cm), 使用2種及以上抗生素時濃度減半。所有BG11或LB固體培養基中補加1.5%瓊脂。接合轉移時向BG11固體培養基添加10 μg/mL硫酸鏈霉素 (Smr) 或25 μg/mL壯觀霉素 (Spr), 篩選雙交換轉化子時向BG11固體培養基中添加5%的蔗糖。質粒pRL443[15]、pRL623[15]和pRL277[16]來自美國密西根州立大學Peter Wolk實驗室。

1.2 DNA操作方法

藍藻基因組的提取參照Cai和Wolk[17]所描述的方法進行, 稍加修改。50 μL PCR反應體系中含25 μL 2×Phanta Max Buffer, 1 μL dNTP Mix (10 mmol/L),上下游引物(10 μmol/L)各2 μL(表 1), 1 μL Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase(1U), 模板DNA適量, 其余用ddH2O補至50 μL。PCR反應程序: 首先, 95℃預變性3min; 然后, 按照95℃變性15s, 58℃退火15s, 72℃延伸1min 30s進行30個循環反應; 最后, 72℃終延伸5min。融合PCR反應參照文獻[18]進行。限制性酶切、連接和轉化等DNA重組操作按Molecular Cloning[19]描述的方法進行。PstⅠ和SacⅠ限制性內切酶、T4 DNA連接酶購自寶生物工程(大連)有限公司。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測后用乙醇沉降并洗滌純化。之后純化的PCR產物經PstⅠ和SacⅠ酶切并克隆至經相同酶切的pRL277中, 所得克隆均經過測序驗證確保沒有發生突變。

表1 本研究中用到的引物Tab. 1 Primers used in this study

1.3 藍藻和大腸桿菌的接合轉移

聚球藻PCC 7942接合轉移參照文獻[20]進行,略有改動。待藻細胞生長至OD730為0.8—1.2時取10 mL藻液離心收集, 用BG11洗3次, 重懸于1 mL的BG11中。同時收集10 mLE. coliHB101 (pRL443+pRL623+運載質粒), 用LB洗滌3次并重懸于1 mL LB中。將藻液和菌液混合, 弱光孵育4h后涂布到覆蓋有硝酸纖維素濾膜的BG11平板上, 每個平板涂布200 μL菌藻混合液。光照24h后將膜轉到含有10 μg/mL硫酸鏈霉素的BG11平板上繼續培養至接合子長出。

1.4 藍藻突變株的篩選

突變株的篩選參考在魚腥藻PCC7120中描述的方法[20], 但篩選雙交換子時不使用任何抗生素標記。先將接合子在含硫酸鏈霉素平板上劃線培養,待長出之后轉接至20 mL含相應抗生素的BG11中傳代培養并提取基因組DNA, 進行PCR檢測篩選完全分離的單交換子。然后, 涂布到含5%蔗糖的BG11固體培養基進行雙交換子的篩選。待雙交換子長出后, 劃線于含5%蔗糖的BG11固體培養基, 再轉接到BG11中進行培養并提取其基因組進行PCR檢測。

2 結果

2.1 用于大片段刪除的質粒構建

利用傳統同源重組技術刪除非必需區域大片段所用的質粒攜帶有兩側同源臂、oriT位點、抗性選擇標記和sacB致死基因, 但不能在藍藻細胞中自主復制。利用接合轉移將構建的質粒轉移到聚球藻PCC 7942中, 質粒通過其中一個同源臂與基因組DNA發生單交換整合到基因組上; 單交換子基因組中的另一同源片段再發生同源重組, 經過含5%蔗糖的BG11的篩選, 殺死攜帶sacB的細胞, 就可實現非必需區域的無標記刪除(圖 1)。

圖1 兩步同源重組刪除大片段的示意圖Fig. 1 A schematic diagram showing the deletion of a large DNA fragment via two-step homologous recombinations將帶有兩側同源序列的質粒通過單交換整合到聚球藻PCC7942基因組中, 獲得帶有Spr/Smr抗性的單交換子; 之后, 在蔗糖平板上篩選發生第二次交換的藻落The plasmid with two homologous DNA fragments was integrated into the genome of Synechochoccus sp. PCC 7942 via single crossover; colonies with double crossover were selected on sucrose-containing plates

為刪除聚球藻PCC 7942基因組中3個大于10 kb的非必需區域, 即Synpcc7942_0050～Synpcc7942_0064(簡稱0050-0064)、Synpcc7942_0233～Synpcc 7942_0253(簡稱0233-0253)、Synpcc7942_1391～Synpcc 7942_1400(簡稱1391-1400), 作者利用pRL277構建了用于相應基因組區段刪除的質粒。以0050-0064為例, 用基因組DNA為模板、以引物0050-0064-F1/R1和0050-0064-F2/R2(表 1)進行PCR擴增,獲得待刪除區域兩側的同源臂, 將二者通過融合PCR獲得的融合片段經PstⅠ和SacⅠ酶切并克隆至質粒pRL277, 得到用于0050—0064基因組區段刪除的質粒pHB6442。用同樣的方法克隆得到用于0233—0253和1391—1400基因組區段刪除的質粒pHB6522和pHB6615。

2.2 單交換子的獲得

接合轉移的完成需要運載質粒、輔助質粒和接合質粒的參與。本實驗中用到的接合質粒為pRL443, 輔助質粒為pRL623。通過轉化將構建的pHB6442、pHB6522 和pHB6615三個運載質粒分別轉入E. coliHB101(pRL443+pRL623), 得到用于接合轉移的3個菌株E. coliHB101(pRL443+pRL623+pHB6442)、E. coliHB101(pRL443+pRL623+pHB6522)

和E. coliHB101(pRL443+pRL623+pHB6615)。

將3個E. coliHB 101(運載質粒+pRL443+pRL623)菌株分別與聚球藻PCC 7942進行接合轉移, 運載質粒轉移到藻細胞中。由于沒有藍藻復制子, 運載質粒不能在藍藻中自主復制, 必須通過其攜帶的同源臂與基因組非必需區域的上游或者下游同源部分發生單交換(圖 2)。通過同源臂發生整合, 運載質粒穩定存在于PCC 7942的基因組上。所有藻株經過多輪的篩選, 以基因特異的引物(表 1)進行PCR檢測。

圖2 單交換子的PCR檢測引物位置示意圖Fig. 2 A schematic diagram showing the location of primers used for PCR detection of single crossover recombinantsF′和R′為兩側同源臂以外序列的引物, F1和R2為用于擴增同源臂的4條引物中的2條, 1和2為待刪除非必需區域內側的引物F′ and R′ are primers beyond the two homologous arms, F1 and R2 are 2 of 4 primers for PCR amplification of the homologous arms,1 and 2 are primers located within the large DNA fragment to be deleted

在Synechococcus7942::pHB6442接合子的PCR檢測中, 發現隨機篩選的接合子中有一半的概率為同時發生上游和下游的單交換整合的突變株(結果未附)。圖 3中泳道1—12為Synechococcus7942::pHB6442同時發生上游和下游單交換整合的突變株檢測。挑選Synechococcus7942::pHB6522和Synechococcus7942::pHB6615的接合子進行PCR檢測時, 未觀察到這種情況。圖 3中泳道13—18為Synechococcus7942::pHB6522 發生下游單交換整合的突變株檢測, 泳道19—24為Synechococ-cus7942::pHB6615發生下游單交換整合的突變株檢測。

圖3 分離完全的單交換突變株的PCR檢測Fig. 3 PCR examination of completely segregated singlecrossover mutants泳道M1為1 kb DNA Ladder, 條帶大小從上而下依次是10、8、6、5、4、3、2、1.5、1.0和0.5 kb; 泳道M2為Trans 5K DNA Marker, 條帶大小從上而下依次是5、3、2、1.5、1、0.8、0.5和0.3 kb; 泳道1和2為pHB6442單交換接合子, 泳道3為野生型, 引物為0050-0064-Fˊ/2; 泳道4和5為pHB6442單交換接合子,泳道6為野生型, 引物為0050-0064-Fˊ/R2; 泳道7和8為pHB6442單交換接合子, 泳道9為野生型, 引物為0050-0064-1/Rˊ; 泳道10和11為pHB6442單交換接合子, 泳道12為野生型,引物為0050-0064-F1/Rˊ; 泳道13和14為pHB6522單交換接合子,泳道15為野生型, 引物為0233-0253-1/Rˊ; 泳道16和17為pHB6522單交換接合子, 泳道18為野生型, 引物為0233-0253-F1/Rˊ; 泳道19和20為pHB6615單交換接合子, 泳道21為野生型,引物為1391-1400-1/Rˊ; 泳道22和23為pHB6615單交換接合子,泳道24為野生型, 引物為1391-1400-F1/RˊLane M1, 1 kb DNA ladder (from top to bottom: 10, 8, 6, 5, 4, 3, 2,1.5, 1.0, 0.5 kb); lane M2, Trans 5K DNA Marker (from top to bottom: 5, 3, 2, 1.5, 1, 0.8, 0.5, 0.3 kb). Lanes 1 and 2 show PCR detection of Synechococcus PCC 7942::pHB6442 singlerecombinants, lane 3 shows detection of the wild type (WT)control, where primers 0050-0064-Fˊ/2 were used. Lanes 4 and 5,Synechococcus PCC 7942::pHB6442; lane 6, WT; primers: 0050-0064-Fˊ/R2. Lanes 7 and 8, Synechococcus PCC 7942::pHB6442;lane 9, WT; primers: 0050-0064-1/Rˊ. Lanes 10 and 11,Synechococcus PCC 7942::pHB6442; lane 12, WT; primers: 0050-0064-F1/Rˊ. Lanes 13 and 14, Synechococcus PCC 7942::pHB 6522; lane 15, WT; primers: 0233-0253-1/Rˊ. Lanes 16 and 17,Synechococcus PCC 7942::pHB6522; lane 18, WT; primers: 0233-0253-F1/Rˊ. Lanes 19 and 20, Synechococcus PCC 7942::pHB 6615; lane 21, WT; primers: 1391-1400-1/Rˊ. Lanes 22 and 23,Synechococcus PCC 7942::pHB6615; lane 24, WT; primers: 1391-1400-F1/Rˊ

2.3 無標記刪除

由于運載質粒上含有蔗糖致死基因sacB, 所以單交換突變株不能在含5%蔗糖的BG11培養基中生長。利用蔗糖篩選第二步交換時, 可能獲得定向突變株, 也可能獲得回復的野生型(決定于哪一側發生交換), 概率各占50%, 因此需要從多個蔗糖抗性的藻落中挑選出無標記刪除突變株。挑取蔗糖平板上獲得的藻落, 擴大培養, 反復篩選, 并進行兩對PCR檢測, PCR擴增30個循環。圖 4顯示最終獲得的無標記刪除突變株ΔSynpcc 0050-0064、ΔSynpcc 0233-0253和ΔSynpcc 1391-1400, 所刪除片段均在10 kb以上, 其細胞中完全沒有野生型基因組存在。

圖4 分離完全的雙交換突變株的PCR檢測Fig. 4 PCR examination of completely segregated double-crossover mutants泳道M為Trans 5K DNA Marker, 條帶大小從上而下依次是5、3、2、1.5、1、0.8、0.5和0.3 kb。泳道1和2為雙交換突變株, 泳道3為野生型, 引物為Fˊ/Rˊ; 泳道4和5為雙交換突變株, 泳道6為野生型, 引物為Fˊ/2Lane M, Trans 5K DNA Marker (from top to bottom: 5, 3, 2, 1.5, 1, 0.8, 0.5, 0.3 kb). Lanes 1 and 2 show PCR detection of double-crossover recombinants, lane 3 shows detection of the wild type (WT) control using primers of Fˊ/Rˊ. Lanes 4 and 5 were double-crossover recombinants; lane 6 was WT using primers of Fˊ/2

3 討論

原核生物中已有若干種報道了基因組的簡化研究。譬如, 在大腸桿菌(Escherichia coli)K-12中刪除不穩定片段和非必需基因, 獲得了基因組減少15%的菌株[21]。該菌株生長能力和蛋白表達特性依舊良好, 并且電擊轉化效率和質粒穩定性等性狀有所提高。再如, 在枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)中刪除非必需基因, 獲得了一系列基因組刪減程度不同的菌株。這些菌株的生長速率和轉化效率變低, 但細胞產量提高[22]。藍藻在微生物合成生物學研究中具有獨特的價值, 基因組簡化也是在藍藻構建良好的底盤細胞所需要的。聚球藻PCC 7942基因組較小, 而且其基因組中的非必需基因已經系統地鑒定, 為此, 我們選用該藻株開展基因組的簡化工作。

借助于同源重組和條件致死基因sacB可在某些細菌獲得無標記的刪除突變株, 應用于基因組簡化[22]。這一過程既可以利用線性DNA轉化細胞來實現, 也可以通過質粒的接合轉移來實現。聚球藻PCC 7942的遺傳操作通常是借助于DNA的轉化作用, 但實際上也完全可以利用接合轉移將質粒導入其細胞, 而對于實現單交換來說, 接合轉移的效率要高得多。本研究結果顯示, 接合轉移可以有效地將質粒導入該藻株, 并獲得單交換子。

在以往的報道中, 利用傳統的同源重組和sacB的條件致死作用可以在藍藻篩選獲得一些小片段DNA刪除的突變株[23]。而且, 由于藍藻細胞中具有多拷貝基因組[24], 使用傳統同源重組技術刪除基因組片段, 在第二步重組篩選時沒有抗性選擇標記, 往往會篩選到未分離完全的突變株, 也就是仍攜帶野生型基因組的突變株。雖然如此, 我們發現利用這一方法可以在聚球藻PCC 7942實現10 kb以上區域的刪除, 并且在3個非必需區域的刪除中都獲得了成功。因此, 應用傳統的方法也可以對藍藻基因組進行大片段刪除, 進而實現簡化。一般來說,第一步同源重組時, 質粒會整合到基因組的上游或者下游, 但是在我們的實驗中也觀察到質粒同時整合到相應位置的上游和下游的情形。選取上下游同時發生單交換的單交換子進行第二步重組篩選,更容易獲得完全分離的缺失突變株。譬如, 在刪除Synpcc7942_0050-0064基因組區段時, 選取上下游同時發生雙交換的藻株進行第二步重組篩選, 所檢測的15個克隆全部為分離完全的缺失突變株。

藍藻的接合轉移和基于sacB的篩選系統最早是在絲狀固氮藍藻發展起來的, 實際上對于單細胞藍藻也是適用的。所以, 我們有理由相信, 本研究展示的大片段基因組刪除方法在可遺傳操作的藍藻中是廣泛適用的。盡管本研究證明傳統的同源重組和篩選技術可以對藍藻基因組大片段進行無標記刪除, 但是其兩步篩選一般耗時較長, 有時還難以獲得完全分離的突變株。已有研究報道,在集胞藻 (Synechocystissp.) PCC 6803、聚球藻(Synechococcussp.) UTEX 2973和魚腥藻 (Anabaenasp.) PCC 7120等3種藍藻中借助Cpf1可實現基因敲入、敲除和定點突變[25]。還有報道顯示,在魚腥藻PCC7120中利用CRISPR/Cpf1基因編輯系統可刪除118 kb大片段[26]。因此, 進一步引入Cpf1等特異的DNA剪切系統或可顯著加速無標記刪除突變株的篩選過程。