絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥患者中醫(yī)證型與腸道菌群結(jié)構(gòu)的相關(guān)性研究

何劍全，林小梅，林正坤，林進(jìn)財(cái)，陳健

廈門大學(xué)附屬中山醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科 福建廈門 361004

骨質(zhì)疏松癥在中國(guó)已成為嚴(yán)重影響中老年人健康的疾病之一[1，2]。國(guó)際骨質(zhì)疏松基金會(huì)（IOF）報(bào)告：全球范圍內(nèi)每3秒鐘就有1例骨質(zhì)疏松性骨折發(fā)生。絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥（Postmenopausal osteoporosis，PMOP）的特征是由于絕經(jīng)后女性雌激素水平下降，導(dǎo)致骨量快速減少，骨微結(jié)構(gòu)破壞，易發(fā)生骨折[3]。PMOP在中醫(yī)學(xué) 歸屬“骨痿”、“骨枯”等范疇。根據(jù)《絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥（骨痿）中醫(yī)藥診療指南（2019年版）》，將PMOP中醫(yī)證型分為肝腎陰虛證、脾腎陽(yáng)虛證和腎虛血瘀證3型[4]。同病異治與辨證論治是中醫(yī)藥臨床應(yīng)用的核心思想，本文旨在探索PMOP的中醫(yī)辨證分型與腸道菌群之間的關(guān)聯(lián)，采用16SrDNA基因測(cè)序技術(shù)，研究不同證型PMOP腸道菌群結(jié)構(gòu)差異，為PMOP的中醫(yī)辨證分型提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。

資料與方法

1 入組標(biāo)準(zhǔn)

1.1 診斷標(biāo)準(zhǔn) 診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥（骨痿）中醫(yī)藥診療指南（2019年版）》[4]和《中醫(yī)藥防治原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥專家共識(shí)（2015）》[5]，并根據(jù)指南進(jìn)行中醫(yī)辨證。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn) ①符合中西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)2位主任醫(yī)師診斷中醫(yī)證型一致；②知情本研究?jī)?nèi)容并簽署知情同意書。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn) ①合并嚴(yán)重心、腎、肝、血液系統(tǒng)功能、內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病、腫瘤患者；②合并精神類疾病及認(rèn)知障礙者；③ 由骨軟化癥、甲狀旁腺激素功能亢進(jìn)、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、腫瘤等藥物使用等引起的繼發(fā)性骨質(zhì)疏松者；④近6個(gè)月內(nèi)使用影響骨代謝的藥物和使用中藥治療者; ⑤近3個(gè)月內(nèi)使用影響腸道菌群的藥物，如抗生素、益生菌、益生元等。

2 一般資料

選擇2019年2月至2020年2月就診于廈門大學(xué)附屬中山醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科的初診PMOP患者88例。所有入組的研究對(duì)象均符合骨質(zhì)疏松癥的中西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)。該試驗(yàn)已通過(guò)廈門大學(xué)附屬中山醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批（No.201808），中國(guó)臨床試驗(yàn)注冊(cè)中心注冊(cè)（ChiCTR1900027187）。

3 數(shù)據(jù)收集

記錄患者的年齡、身高、體重、BMI、中醫(yī)證型等信息。采用雙能X線骨密度儀（GE Lunar Prodigy，美國(guó)）測(cè)量腰椎L1-4、股骨頸和全髖骨密度值。采用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定血清雌激素、空腹血清I型膠原交聯(lián)C-末端肽（Serum C-terminal telopeptide of type I collagen， S-CTX）和血清1型原膠原N-端前肽（Procollagen type 1 N-peptide， P1NP）；糞便樣本采用裝有保護(hù)液[6]的采樣管取樣。

4 糞便DNA測(cè)序

糞便DNA提?。翰捎眉S便DNA提取試劑盒（QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit）提取糞便DNA。對(duì)應(yīng)引物區(qū)域：16S V3-V4區(qū)引物（正向引物序列為5’- CCTACGGGNBGCASCAG-3’，反向引物序列為5’- GGACTACNVGGGTWTCTAAT-3’）；擴(kuò)增子文庫(kù)構(gòu)建：采用兩步擴(kuò)增法對(duì)樣品細(xì)菌的16sDNA基因的V3-V4區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增及加測(cè)序接頭完成文庫(kù)構(gòu)建；NovaSeq（Illumina， 美國(guó)）上機(jī)測(cè)序。

5 數(shù)據(jù)分析

5.1 測(cè)序數(shù)據(jù)處理 將下機(jī)數(shù)據(jù)拆分出各樣品數(shù)據(jù)，截除Barcode和引物序列對(duì)后續(xù)PE Reads拼接，進(jìn)行Tags過(guò)濾，拼接成Raw Tags，再經(jīng)過(guò)嚴(yán)格地過(guò)濾處理后得到高質(zhì)量的Tags數(shù)據(jù)（Clean Tags）。

5.2 OTU聚類和物種注釋

5.2.1 OTU聚類 利用USEARCH 軟件對(duì)全部Effective Tags聚類分析。

5.2.2 物種注釋 使用RDP Classifier與Silva數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)物種進(jìn)行注釋分析（閾值0.97），按細(xì)菌不同分類水平：Kingdom（界），Phylum（門），Class（綱），Order（目），F(xiàn)amily（科），Genus（屬）統(tǒng)計(jì)各樣本的菌群落構(gòu)成。

5.2.3 OTUs系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系構(gòu)建 快速多序列比對(duì)使用MUSCLE軟件，所得的OTUs代表序列的系統(tǒng)實(shí)際發(fā)生關(guān)系。

5.3 多樣性分析（α-diversity） α-diversity用于分析各樣品內(nèi)（Within-community）的微生物群落多樣性，利用單樣本的α-diversity分析反映樣品內(nèi)的菌群落的多樣性豐度。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。5.4 多樣品比較分析（β-diversity） 使用R包vegan計(jì)算OTUs的Bray-Curtis距離。采用主坐標(biāo)分析（Principal Co-ordinates Analysis， PCoA），相似性分析（Analysis of similar， ANOSIM）等多變量統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，進(jìn)一步挖掘樣品間微生物群落結(jié)構(gòu)差異和不同分類對(duì)樣品間的貢獻(xiàn)差異。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

5.5 LEfSe分析 采用Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)分析不同分組間豐度差異顯著的物種，利用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)分析顯著性差異物種中的所有亞種，比較是否都趨同于同一分類級(jí)別，最后用線性判別分析（LDA）評(píng)估顯著差異菌群種類的影響力。

5.6 臨床指標(biāo)與菌群的相關(guān)性分析 利用R包psych進(jìn)行相關(guān)性分析，得出臨床指標(biāo)和菌群之間的相關(guān)性和顯著性，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 88例PMOP患者不同證型基本信息

共收集了PMOP患者88例，其中肝腎陰虛證36例、脾腎陽(yáng)虛證28例和腎虛血瘀證24例，各組年齡、BMI、骨密度、雌激素、S-CTX和P1NP差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1。

表1 88例PMOP患者不同證型基本信息

2 各證型菌群在α多樣性差異比較分析

分析PMOP患者3種證型腸道菌群的6個(gè)α多樣性指數(shù)（Observe、Evenness、ACE、Chao1、Shannon、Simpson），多樣性指數(shù)值越高，說(shuō)明菌群落的多樣性越高。肝腎陰虛型、脾腎陽(yáng)虛型與腎虛血瘀型相比，菌群的Observe指數(shù)更高，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。但是，3種證型在Evenness、ACE、Chao1、Shannon、Simpson指標(biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖1。

圖1 各證型腸道菌群在α多樣性差異比較分析

3 各證型菌群組間成分差異分析

Venn圖分析發(fā)現(xiàn)肝腎陰虛證、脾腎陽(yáng)虛證和腎虛血瘀證獨(dú)有的菌屬依次為46、24、23種（圖2A）。各證型排名前10的菌屬豐度主要集中在Bacteroidales、Prevotella、Phascolarctobacterium、Escherichia-Shigella、Klebsiella、Faecalibacterium、Roseburia、Veillonella、Lachnoclostridium和Alistipes。（圖2B）。PCoA、ANOSIM分析證實(shí)3種證型在腸道菌群的屬水平存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖2C-D，P<0.01）。

圖2 各證型菌群組間成分差異分析

4 各證型菌群菌屬間的熱圖分析

在豐度熱圖中（圖3）顯示，在細(xì)菌屬水平，肝腎陰虛型患者的菌群含量豐富的為L(zhǎng)achnospira、Prevotella、Bacteroidales，豐度最低的為Peptostreptococcus。脾腎陽(yáng)虛型患者菌群含量豐富的為Subdoligranulum、Howardella，豐度最低的為Bifidobacterium、Blautia及Muribaculaceae。腎虛血瘀型患者的菌群含量最豐富為Phocaeicola，豐度最低為Mitsuokella和Phascolarctobacterium。

圖3 各證型腸道菌群菌屬豐度分析

5 各證型菌群菌屬間菌群LEfSe分析

LEfSe分析可以分析組間菌群差異，找出各組間差異的微生物種類，可用于開發(fā)生物標(biāo)志物等研究。在上述3個(gè)證型中，設(shè)定LDA閾值為3，篩選了相應(yīng)證型的特征菌群，具體菌群如圖4所示。3個(gè)證型中腎虛血瘀型分析出16種特征差異菌群，肝腎陰虛型證型和脾腎陽(yáng)虛型都有5種特征差異菌。

圖4 各證型菌屬間腸道菌群LEfSe分析

6 PMOP患者臨床指標(biāo)與特征差異菌的相關(guān)性分析

相關(guān)性熱圖（圖5）顯示與年齡成正相關(guān)菌屬有Butyrivibrio，負(fù)相關(guān)的有Bifidobacterium、Citrobacter和Morganella；與BMI成負(fù)相關(guān)菌屬有Peptostreptococcus和Phocaeicola；與血清雌激素成正相關(guān)菌屬有Howardella和Phascolarctobacterium，負(fù)相關(guān)的有Muribaculaceae；與腰椎骨密度成負(fù)相關(guān)的菌屬有Prevotella；與股骨頸骨密度成正相關(guān)的菌屬有Morganella，負(fù)相關(guān)的有Muribaculaceae和Lachnospira；與全髖骨密度成正相關(guān)的菌屬有，負(fù)相關(guān)有Bacteroidales、Peptostreptococcus；與S-CTX成 正 相關(guān)的菌屬有Blautia和Howardella，負(fù)相關(guān)有Phocaeicola; 與P1NP成正相關(guān)的菌屬有Bifidobacterium和Blautia。

圖5 PMOP患者臨床指標(biāo)與差異菌群的相關(guān)性

討 論

基于中醫(yī)學(xué)辨證論治，PMOP為本虛標(biāo)實(shí)之證，五臟均與POMP的發(fā)生密切相關(guān)，主要病變臟腑在肝、脾、腎，多以氣滯血瘀為表證。歷代醫(yī)家多從脾虛、腎虛辨證，久虛致肝腎陰虛，脾腎陽(yáng)虛，且久虛必瘀，如有外傷，引發(fā)骨折，血滯經(jīng)絡(luò)，血瘀加重[5]。因此，最新的指南將POMP分類為脾肝腎陰虛證、腎陽(yáng)虛證、腎虛血瘀證3種證型，其中以肝腎陰虛證多見[4]。

近年來(lái)，有學(xué)者提出“腸-骨軸”理論，發(fā)現(xiàn)腸道微生態(tài)可直接或間接影響骨代謝，腸道菌群的失調(diào)可導(dǎo)致骨重建失衡，而調(diào)節(jié)腸道菌群具有防治骨質(zhì)疏松的作用[7-8]。最新研究發(fā)現(xiàn)我國(guó)PMOP患者腸道菌群的豐富度和多樣性降低，與腰椎BMD顯著相關(guān)；骨代謝指標(biāo)與骨量減少患者Allisonella，Klebsiella和Megasphaera正相關(guān)[9]。以上研究說(shuō)明腸道菌群改變與骨質(zhì)疏松患者密切相關(guān)?；贠bserve指數(shù)分析，PMOP腎虛血瘀型患者的菌群α多樣性低于肝腎陰虛型、脾腎陽(yáng)虛型；但是，采用PCoA和ANOSIM分析表明組間差異顯著，肝腎陰虛型、脾腎陽(yáng)虛型明顯低于腎虛血瘀患者，該結(jié)果為菌群多樣性區(qū)分PMOP腎虛血瘀型和另外兩種證型提供參考依據(jù)。

另外，本研究將PMOP患者的中醫(yī)證型與腸道菌群相關(guān)性進(jìn)行分析，從菌群多樣性、組間特征差異菌群分析、臨床指標(biāo)與特征差異菌的相關(guān)性等來(lái)觀察不同中醫(yī)證型的腸道菌群改變特征。基于中醫(yī)體質(zhì)辨證的研究發(fā)現(xiàn)，陰虛質(zhì)女性腸道菌群豐度最大的前3位菌屬分別是Veillonococcus，Ruminococcus和Koalabacteria[10]。而本研究發(fā)現(xiàn)PMOP肝腎陰虛型腸道菌群豐度較高的是Lachnospira、Prevotella、Bacteroidales，而Peptostreptococcus相對(duì)較低。然而，在脾腎陽(yáng)虛型PMOP患者腸道中富集Subdoligranulum、Howardella，這與單純陽(yáng)虛質(zhì)人群腸道內(nèi)富含Brevundimonas、Leuconostoc、Turieibacter等菌群并不完全一致[11]。Zhang等[12]研究發(fā)現(xiàn)脾陽(yáng)虛患者的腸道內(nèi)Firmicutes豐度高于健康人群，而Bacteroides豐度則顯著減少，由此提出Firmicutes增高可能影響脾陽(yáng)虛患者代謝水平。另有研究報(bào)道腎陽(yáng)虛患者的乳桿菌屬等益生菌顯著下降[13]，本研究則發(fā)現(xiàn)PMOP脾腎陽(yáng)虛型患者Bifidobacterium等益生菌減少。另外，本研究觀察到腎虛血瘀型PMOP患者不同于另外兩種證型的差異性腸道菌群。上述篩選出的特征差異菌屬可作為中醫(yī)證型的腸道微生態(tài)學(xué)檢測(cè)指標(biāo)，為中醫(yī)證型微觀化診斷提供理論基礎(chǔ)。但是，由于腸道菌群受到到飲食、地域、人種、疾病、體質(zhì)等多種因素的影響[14]，需要大型臨床流行病學(xué)調(diào)查加以驗(yàn)證，并且在未來(lái)研究中進(jìn)行因果性驗(yàn)證。

最后，我們將PMOP患者的骨代謝、骨密度等指標(biāo)與特征差異菌群進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）等有益菌與年齡呈負(fù)相關(guān)。隨著年齡的增長(zhǎng)，老年人腸道有益菌逐步減少，有害菌增多，菌群失調(diào)加劇導(dǎo)致各種疾病發(fā)生[15]。同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)Bifidobacterium與P1NP呈正相關(guān)，說(shuō)明該有益菌與骨形成密切相關(guān)。有研究表明我國(guó)老年人的腸道Bifidobacterium，Lactobacillus等有益菌與骨密度值呈正相關(guān)[16]。因此，Jafarnejad等[17]通過(guò)臨床試驗(yàn)證實(shí)補(bǔ)充干酪乳桿菌、長(zhǎng)雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌等7種混合益生菌可降低絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松患者S-CTX，抑制骨吸收。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)單純使用長(zhǎng)雙歧桿菌、羅伊氏乳桿菌等益生菌可防止骨丟失，增加骨密度[18]。由此可見，通過(guò)調(diào)節(jié)腸道菌群是防治PMOP有效方法[19，20]。

本研究探索了PMOP不同中醫(yī)證型的腸道菌群結(jié)構(gòu)，其多樣性改變以及相應(yīng)特征差異菌群有望作為該證型的微生物學(xué)標(biāo)志物；從腸道微生態(tài)角度證實(shí)PMOP中醫(yī)證型與腸道菌群相關(guān)性，為PMOP輔助診斷、轉(zhuǎn)化應(yīng)用以及腸道菌群干預(yù)提供理論依據(jù)，從腸道微生態(tài)學(xué)角度驗(yàn)證辨證論治的中醫(yī)核心思想。