中性粒細胞胞外誘捕網在原發性膽汁性膽管炎患者中的作用初步探析

偶繹顏， 崔娜娜， 李 瑤， 錢其煒， 馬 雄， 尤征瑞， 連 敏， 王綺夏

上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院 消化內科， 上海市消化疾病研究所， 上海 200001

原發性膽汁性膽管炎(PBC)是一種以漸進性肝內小葉間膽管破壞為特征的自身免疫性肝病[1]。好發于中老年女性，多數患者可出現血清ALP、GGT升高以及乏力、瘙癢等癥狀[2-3]。近90%～95%的患者血清抗線粒體抗體陽性[4]。人體外周血的中性粒細胞數量多、壽命短，具有向炎癥部位遷移的能力。同時，還具有吞噬、脫顆粒以及新近發現的釋放中性粒細胞胞外誘捕網(neutrophil extracellular traps，NET)功能[5]。上述特征使之成為人體固有免疫系統的重要組成部分。中性粒細胞可以在感染和無菌性炎癥的條件下，通過鈣動員或產生活性氧的分子機制形成NET，這種產生NET的方式是不同于凋亡和壞死的NETosis形式[6]。NET是由組蛋白和抗菌肽等修飾的DNA構成的網狀結構，越來越多研究[7-9]表明NET與炎癥或者自身免疫性疾病有關，包括系統性紅斑狼瘡、類風濕關節炎以及炎癥性腸病等。本研究旨在探索NET與PBC之間的相關性，為臨床診治提供新思路。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取2016年8月—2020年8月在上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院消化內科診斷為PBC的患者24例以及與PBC患者年齡相匹配的自身免疫性肝炎(AIH)患者19例、原發性硬化性膽管炎(PSC)患者8例和健康對照(HC)18例。其中，PBC的診斷符合《原發性膽汁性肝硬化(又名原發性膽汁性膽管炎)診斷和治療共識(2015)》[10]，AIH的診斷符合國際自身免疫性肝炎學組制定的AIH簡化診斷積分系統[11]，PSC的診斷符合《原發性硬化性膽管炎診斷和治療專家共識(2015)》[12]。

1.2 臨床資料 收集PBC、AIH、PSC患者和HC組的人口學基本資料。此外，PBC患者進一步收集病史資料以及實驗室檢查指標，包括肝生化指標、自身免疫相關抗體和血清免疫球蛋白等。后續對PBC患者的上述實驗室指標與NETosis標志物髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)水平進行相關性分析。

1.3 實驗方法

1.3.1 分離中性粒細胞 采用EDTA抗凝管抽取PBC患者和HC組全血2 mL，利用密度梯度離心法提取中性粒細胞。向15 mL離心管中順次加入人中性粒細胞分離液Histopaque-1119、Histopaque-1077(美國Sigma公司)和全血，1850 r/min離心30 min，對中性粒細胞進行分離。吸取第二層懸浮細胞，然后用裂紅液(美國Sigma公司)進行裂紅，用RPRI1640洗滌、重懸。顯微鏡下計數、流式檢測中性粒細胞的純度及活率[13]。

1.3.2 檢測NET形成水平 從PBC患者和HC組外周血中按上述方法分離出中性粒細胞后，以約2×104個細胞分別加入48孔培養板中，每孔加入200 μL細胞懸液，以終濃度100 ng/mL的佛波酯(phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA)加入陽性對照組[14-15]。同時，在陽性對照組及空白組加入終濃度250 nmol/L的Sytox green(美國Invitrogen公司)。37 ℃恒溫條件下孵育4 h，用熒光顯微鏡進行觀察。

1.3.3 檢測血清對NET生成的影響 分離HC組外周血中性粒細胞，約2×104個細胞加入48孔培養板，分為兩組：一組加入10%的HC血清，另一組加入PBC患者血清，兩組皆加入終濃度250 nmol/L的Sytox green，在37 ℃進行孵育[16]，4 h后進行觀察。

1.3.4 ELISA法檢測血清中MPO水平 收集PBC、AIH、PSC患者和HC組的血清，保存在-80 ℃冰箱。實驗前將血清恢復至室溫，混勻并離心，取上層清液，采用ELISA法(MPO檢測試劑盒，貨號SEA601Hu，武漢云克隆公司)測定MPO水平。

1.3.5 肝組織免疫熒光檢測 收集PBC患者和HC組肝組織冰凍樣本各5例(HC的肝組織來源于本院行肝血管瘤切除術時的正常肝組織)，制成切片后依次用甲酸通透、PBS洗滌、驢血清封閉，然后滴加一抗(抗MPO抗體：貨號AF3667，美國R&D Systems公司；抗組蛋白H3抗體：貨號ab5103, 美國Abcam公司)，4 ℃濕盒過夜。次日復溫1 h后，PBS洗滌，滴加與一抗結合的二抗，室溫孵育30 min。PBS洗滌，滴加DAPI染細胞核，蓋上蓋玻片。制片完成后在熒光共聚焦顯微鏡下進行觀察。

2 結果

2.1 PBC患者外周血NETosis的標志物升高 各組年齡分別為(44.67±13.51)歲、(45.63±11.64)歲、(40.63±14.00)和(47.33±9.00)歲。HC、AIH和PBC組患者均為女性；PSC組中女性4例，男性4例。PBC組血清中的MPO水平[811.21(450.67～1 216.20)ng/mL]較AIH組[468.58(142.63～812.43)ng/mL]和HC組[357.54(203.52～811.21)ng/mL]明顯升高(P值均<0.05);提示在PBC患者外周血中，NET的產生量顯著增加。PSC患者血清中MPO水平[763.56(489.59～1 633.14)ng/mL]也較HC組顯著升高(P<0.05)(圖1a)。進一步分析PBC相關抗體表達與MPO水平的相關性，結果顯示均無顯著性差異(P值均>0.05)(圖1b～f)。

2.2 NET的含量與肝臟生化指標的相關性 結果表明，隨著外周血NET水平的升高，ALP、GGT、AST、ALT皆呈現上升趨勢，其他指標則不存在顯著相關性，提示GGT、ALP、AST、ALT水平的升高與NET水平在疾病狀態下升高存在正相關(P值均<0.05)(表1，圖2)。

2.3 PBC患者肝組織內存在NET NET在人體組織內的表達可以由MPO和瓜氨酸組蛋白H3(cit histone H3, H3Cit)共定位來明確[17]。通過免疫熒光共聚焦方法觀察到PBC患者的肝組織中存在MPO和H3Cit的共定位，而在HC組的肝組織中則沒有觀察到二者的共定位(圖3)。

表1 PBC患者肝臟生化指標基本資料Table 1 Basic information of liver biochemical indicatorsin PBC patients

注:a，4組血清中MPO水平；b，PBC患者血清線粒體抗體(AMA)陽性或陰性者MPO水平；c，PBC患者血清抗2-丙酮酸脫氫酶(M2-3E)抗體陽性或陰性者MPO水平；d，PBC患者血清抗線粒體-M2型抗體(M2)陽性或陰性者MPO水平；e，PBC患者血清抗斑點蛋白抗體(sp100)陽性或陰性者MPO水平； f，PBC患者血清抗糖蛋白210抗體(gp210)陽性或陰性者MPO水平。

圖2 MPO水平與PBC患者肝功能和IgM的相關性分析Figure 2 Correlation analysis of MPO level with liver functionand immunoglobulin M in PBC patients

注：a，PBC組；b，HC組；藍色(DAPI)；紅色(MPO)；綠色(H3Cit)。圖3 肝組織中免疫熒光共聚焦定位NETFigure 3 Immunofluorescence confocal localization of NETin liver

2.4 PBC患者的外周血中性粒細胞有更強的NET產生能力 分別分離出PBC患者和HC的外周血中性粒細胞，37 ℃孵育4 h，作為空白對照。同時，在兩組中性粒細胞中都加入等量PMA，37 ℃刺激4 h，作為陽性對照。無論空白對照組還是陽性對照組，PBC患者的中性粒細胞都能產生更多的NET。上述實驗結果提示PBC患者的外周血中性粒細胞有更強的NET產生能力和自發產生NET的傾向(圖4)。此外，除去對中性粒細胞自身NET產生能力的觀察，本研究同時探索了PBC患者血清在NET產生過程中發揮的作用。將分離出的HC外周血中性粒細胞分別用HC血清和PBC血清進行處理。結果發現，在10%血清的孵育下，PBC患者的血清較HC的血清更易刺激中性粒細胞產生NET。提示PBC患者的血清中存在某些物質或可促進中性粒細胞NET的產生(圖5)。

注：a，HC組外周血中性粒細胞空白組；b，PBC組外周血中性粒細胞空白組；c，HC組外周血中性粒細胞PMA組； d，PBC組外周血中性粒細胞PMA組。

3 討論

自身免疫肝病涉及多種免疫細胞，疾病早期可有肝臟內中性粒細胞聚積的現象[18]。在肝臟炎癥中，中性粒細胞浸潤膽管數量與疾病進展和膽汁淤積呈正相關[19]。

注：a，外周血中性粒細胞加10%健康人血清孵育后；b，外周血中性粒細 胞加10%PBC患者血清孵育后。

NET在其他自身免疫性疾病中的存在及其相關性提示它在疾病發生發展中起著關鍵作用[20-22]。目前尚未有研究闡明NET在PBC中的具體作用，筆者觀察到NET的產生與PBC患者血清ALP、GGT、AST和ALT水平升高存在正相關。NET是以DNA為骨架，MPO、中性粒細胞彈性蛋白酶(neutrophil elastase，NE)、組蛋白等蛋白質附著形成的網狀結構，是新近發現的中性粒細胞參與機體免疫的形式。筆者采用ELISA法檢測研究對象血清MPO水平來評估NET的含量。雖然這種方法存在一定局限性，但有研究同時使用多指標評估NET水平，疾病組與對照組之間各指標的趨勢一致，且以MPO作為衡量NET水平時，疾病組與健康對照組之間差異更為顯著[23]。肝組織免疫熒光共聚焦的結果也提示在PBC患者肝臟中有更多的NET產生，在健康對照組則很少呈現NET產生。上述結果或可為緩解PBC患者膽汁淤積提供新的治療角度。

在白塞病、系統性紅斑狼瘡等疾病中[24-25]，中性粒細胞自發產生NET的能力增加，本研究也對PBC患者中性粒細胞NET產生能力進行了檢測。中性粒細胞在發生NETosis時，細胞膜結構被破壞，活細胞染料Sytox green可以通過受損胞膜進入胞質，將染色質著色。對于胞膜結構完整的細胞，則無法進行核質的染色。筆者觀察到PBC患者的中性粒細胞在無刺激的條件下自發產生的NET高于HC組；進一步PMA刺激后，PBC患者NET的產生量仍高于HC組。這些結果提示，PBC患者的中性粒細胞無論是自發產生NET的傾向還是在接受外界刺激時產生NET的能力均較HC組更強。近年的研究表明，NET的過量產生和清除障礙參與了多種肝臟疾病的發生發展，包括缺血再灌注損傷、急/慢性肝衰竭等[26]。除了中性粒細胞本身產生NET的能力和傾向的增強，PBC患者體內是否存在某些因素可以激發中性粒細胞產生NET也是需要關注的問題。筆者猜測PBC患者的血清中可能存在某些物質促進了中性粒細胞產生NET，但是與PMA刺激相比，血清對中性粒細胞產生NET的刺激強度較弱。促進和抑制或者降解NET的成分達到平衡狀態，可以維持正常生理狀態下人體內很少的NET產生量。但PBC患者體內可能由于刺激產生NET的物質增加或者抑制及降解NET的物質減少，導致二者間平衡被打破，中性粒細胞進而產生了更多的NET，相關機制后續將進一步探究。

倫理學聲明：本研究取得所有受試者知情同意，并于2020年8月7日獲得上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院醫學倫理委員會的批準，批號：SK2020-003。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監護人以及與公開研究成果有關的利益沖突。

作者貢獻聲明：偶繹顏負責所有實驗和數據分析、撰寫論文；崔娜娜負責收集分析病例資料和ELISA實驗；李瑤、錢其煒參與數據收集；馬雄、尤征瑞負責課題設計；王綺夏、連敏負責課題設計，指導撰寫文章并最后定稿。