環境因子對中華雙扇蕨孢子萌發的影響

歐陽康婷, 龐金輝, 余小玲, 許展慧, 任海*, 王發國*,馬國華, 劉宗君, 胡明鋒, 張亞堅, 譚廣文

環境因子對中華雙扇蕨孢子萌發的影響

歐陽康婷1,2, 龐金輝1,2, 余小玲3, 許展慧1,2, 任海1,2*, 王發國1,2*,馬國華1, 劉宗君4, 胡明鋒4, 張亞堅4, 譚廣文5

(1. 中國科學院華南植物園，廣東省應用植物學重點實驗室，廣州 510650；2. 中國科學院大學，北京 100049；3. 仲愷農業工程學院，廣州 510650；4. 廣東南嶺國家級自然保護區管理局，廣東 韶關 512727；5. 廣州普邦園林股份有限公司, 廣州 510650)

為了解珍稀瀕危植物中華雙扇蕨()瀕危原因，研究了溫度和濕度對其孢子萌發的影響。結果表明，中華雙扇蕨孢子萌發能力較強，萌發方式為型，配子體萌發為型。中華雙扇蕨孢子繁殖不受溫度影響，而濕度顯著影響孢子繁殖過程，濕潤環境中孢子正常萌發，并形成心形配子體，順利長出幼孢子體；而干旱環境下孢子難以萌發,配子體形態不規則發育，褶皺增加。中華雙扇蕨在不適環境下孢子繁殖存在障礙，可能是導致其野生種群及數量下降的原因之一，對這類珍稀瀕危植物的就地和遷地保護需要注意營造濕潤的生境。

中華雙扇蕨；環境因子；組織培養；配子體；形態發育

許多蕨類植物由于自然和人為干擾而處于珍稀瀕危狀態，急需開展繁殖過程研究，為保護和利用提供支撐。蕨類植物是具有兩個能獨立生活的植物體，即孢子體和配子體[1]。孢子體和配子體的生活策略并不相同。在野外難以發現蕨類配子體，而孢子繁殖研究有助于揭示蕨類孢子-配子體-孢子體的發育過程。目前，我國報道了孢子繁殖研究的僅有34科80屬157種蕨類植物，占全國蕨類植物總數的5%[2]，需要對更多的、尤其是珍稀瀕危蕨類的孢子繁殖進行研究。

雙扇蕨科(Dipteridaceae)屬于真蕨綱薄囊蕨亞綱，起源于2.5億年前的中生代早期，有7屬百余種在中生代遍布全球，物種非常豐富，但至今僅存1屬8種，分布在熱帶-亞熱帶地區，為孑遺植物[1,3]。從一個地質歷史上分布很廣泛的類群成為現在的孑遺類群，這可能與雙扇蕨科植物的繁殖特征和適應能力有一定聯系。中華雙扇蕨()是雙扇蕨科雙扇蕨屬植物，小型或中型草本，陸生或石縫生[4]。中華雙扇蕨具有重要的觀賞、藥用和科研價值, 被列為珍稀瀕危物種[5]，也是廣東和湖南省重點保護的野生植物，主要零星分布在中國廣東、廣西、重慶、貴州、云南、湖南，中南半島和緬甸北部[1]。

目前，關于中華雙扇蕨的研究主要有分類修正[6]、系統進化史評估[7]、形態學[8]和化合物提取及應用[9]，對雙扇蕨()[10]和喜馬拉雅雙扇蕨()[11]的配子體發育過程和生長素與生根關系的研究已有報道。Ouyang等[12]在南嶺國家級自然保護區的中華雙扇蕨群落調查中發現幼苗數量少，種群結構衰退，孢子實生苗極其少見。然而，中華雙扇蕨孢子體積很小，通過風可進行遠距離散播[13]，遇適宜的生境便會萌發，推測中華雙扇蕨孢子繁殖和配子體適應能力可能是導致該類群數量少且物種單一的原因。而配子體形態對蕨類演化和發育以及生態適應具有重要的意義[14]。本研究通過采集成熟孢子，設置不同溫度和濕度的培養環境，探討孢子萌發率和配子體形態特征的變化，為中華雙扇蕨的保護和利用提供科學參考。

1 材料和方法

1.1 孢子材料

2020年12月初，在南嶺國家級自然保護區(24° 42′～24°47′ N, 112°51′～112°57′ E)的中華雙扇蕨種群中剪取3株中華雙扇蕨成熟植株的1/2葉片(有成熟孢子囊)，放進硫酸紙折成的簡易信封中帶回實驗室，豎直放置在自然干燥、無風、避光環境下，約7 d后孢子囊因自然干燥開裂，孢子彈射在硫酸紙上, 用1 mL離心管將孢子收集，放入-4 ℃冰箱保存備用。

1.2 孢子培育和觀察

取出裝有孢子的離心管，加入1 mL 5% NaClO溶液，不間斷振蕩消毒10 min后，10 000×離心2 min，無菌水洗滌離心重復3次，倒出廢液后, 制成孢子懸濁液。用已消毒滅菌的鑷子沾取孢子均勻接種在1/2MS培養基中，設置自然溫度(10℃,孢子成熟期的均溫)、25℃、不加水和加2 mL水共4組處理，置于人工培養箱(RXZ-1000B型，寧波江南儀器廠)中培養，培養條件為溫度10℃/25℃, 濕度78%～80%，光照14 h/d，黑暗10 h/d，光照強度約90mol/(m2·s)。以出現假根為標準計算萌發率[15]。統計萌發率后將其轉到濕潤和干旱泥炭土培養盒中繼續培養，將2等份已處理的泥炭土用無菌水充分潤濕后，將培養基中片狀體均勻地移入培養盒中并蓋好，相同的水分控制，濕潤培養盒3～5 d加水1次，培養條件相同。以上操作均在超凈臺完成。

接種15 d后開始觀察，在孢子開始萌發及配子體發育時期，選取典型材料制成臨時裝片，放置在電鏡(JSM-6360LV, JEOL, Japan)和光學顯微鏡下(Olympus-BH2, Japan)，并用ECLIPSE-E600相機(Nikon, Japan)觀察記錄，保持同倍數鏡頭隨機選擇5個視野，拍照計數20個孢子，以平均值為最終結果[16]。

1.3 數據處理

將所有數據錄入Microsoft Excel 2013，采用R 3.6.3進行單因素方差分析，以<0.01表示差異顯著，使用Adobe Photoshop CC 2019處理圖片。

2 結果和分析

2.1 孢子囊和孢子形態

中華雙扇蕨孢子囊近圓形、細小，橙黃色，肉眼無法觀察(圖1: A)，具有縱生環帶，中部開裂彈射孢子。成熟孢子為透明色或淺黃綠色，極面觀為橢圓形，兩端稍平鈍；赤道面觀為豆形, 但近極面較平；孢子大小約為20.1m×40.0m; 孢子為單列縫，幾乎長達孢子赤道線(圖1: B, C)。還觀察到極個別孢子為3裂縫(圖1: D)。孢子外壁厚約1.0m (圖1: E)，沒有明顯的分層現象，附有一層薄薄的外膜，表面光滑，未見清晰的紋飾(圖1: F)。

圖1 中華雙扇蕨孢子囊和孢子。A: 孢子囊; B, C: 單裂縫孢子; D: 三裂縫孢子; E: 孢子壁; F: 孢子紋飾; As: 環帶; Mi: 單裂縫; Ti: 三裂縫; Sd: 孢子壁; Me: 薄膜。

2.2 孢子萌發

孢子播種20～25 d體積開始稍微變大(圖2: A)，隨后孢子內原生質逐漸收縮，同時產生若干個大小不一的葉綠體細胞(圖2: B)。35 d后，孢子壁從裂縫處伸出1條假根，似圓狀，無色透明，有一層薄膜(圖2: C)，隨著假根伸長，可以清楚地觀察到根部的綠色顆粒物質(圖2: D)。初生假根一般垂直于近極面，首端不發生彎曲，極少數微微彎曲，向下生長(圖2: E)。繼續培養根部顆粒物逐漸消失，慢慢形成枝干形態(圖2: F)。

圖2 中華雙扇蕨孢子萌發。A: 孢子變大; B: 初生假根(Pr); C: 假根內葉綠體; D: 初生假根基部膨大; E～F: 長假根。

2.3 片狀體

繼續發育至片狀體階段時，中華雙扇蕨片狀體形態變化多樣，主要有片形片狀體和立體片狀體。中華雙扇蕨的片狀體有條形、圓形、方形、或者不規則形(圖3: A～F)，隨著片狀體細胞不斷分化生長，其底部假根的數量也在增加。片狀體的生長點兩側細胞分裂速率快慢，決定了后期原葉體的形狀。隨著片狀體細胞不斷分裂和發育，逐漸長出原葉體(配子體)，但后期也會出現特殊形狀的片狀體(圖3: F)。

2.4 原葉體

原葉體也稱配子體，正常發育成熟的原葉體呈對稱的心形(圖4: A, B)，原葉體邊緣較平滑，假根在腹面兩側均有生長(圖4: B)，顏色也逐漸變成淺褐色(圖4: B)。毛狀體會在配子體時期出現，為乳突毛狀體，散亂地分布在配子體上(圖4: C)。性器官雜亂地出現在原葉體的腹部假根叢中，或者附著在邊緣細胞的表面(圖4: C, D)。中華雙扇蕨的頸卵器，與大多數蕨類植物的頸卵器有著相同的特征,屬于包埋型(圖4: C)。頸卵器發生在配子體的表面細胞，其頸部由4列5層細胞構成。成熟的中華雙扇蕨配子體腹面、中肋和邊緣都分布著許多頸卵器, 待發育成熟后，頂端開裂；而精子器散生在原葉體邊側或背部，圓球形，與水龍骨科(Polypodiaceae)和紫萁科(Osmundaceae)植物精子器相似，均屬于突出型(圖4: D)。在有水環境下，精子器發育成熟釋放大量的精子，精子進入頸卵器, 與卵結合進而發育成胚,最終形成幼孢子體(圖4: E, F)。幼孢子體從成熟的原葉體腹面假根中長出，而原葉體逐漸變透明。一般幼孢子體為兩側對稱的心形狀，可以清晰看見孢子葉上有葉脈(圖4: F)。

圖3 中華雙扇蕨的片狀體。A: 條形; B: 圓形; C: 方形; D～E: 不規則形; F: 特殊形狀片狀體后期。

圖4 中華雙扇蕨原葉體。A, B: 心形原葉體; C: 頸卵器; D: 精子器; E: 幼孢子體; F: 心形幼孢子體; Mt: 乳突毛狀體; Ap: 生長點; Rh: 假根; Ga: 配子體; Ve: 葉脈。

2.5 干旱培養條件下配子體形態特征

在干旱環境下培養，原葉體停止發育或呈不規則形狀(圖5: A～D)。背部和底部涌現大量假根(圖5: A)，假根由褐色逐漸加深，配子體的褶皺增加(圖5: B～D)，配子體的生長點附近保持綠色并緩慢生長，其余部分變為淺褐色。

2.6 孢子萌發率

由圖6可見，在自然溫度(10 ℃)和25 ℃下培養，除第26天自然溫度的萌發率略低于25 ℃的外，兩者的孢子萌發率沒有顯著差異。環境濕潤程度對孢子的萌發率有顯著影響(<0.01)，與濕潤環境相比，干旱條件下的孢子萌發率極低，僅在第50天才觀察到極個別孢子有萌發跡象。

3 結論和討論

3.1 孢子萌發過程

中華雙扇蕨孢子繁殖周期約4個月左右，經歷5個階段，分別是孢子萌發及初生假根期、絲狀體期、片狀體期、原葉體期和幼孢子體期。首先單裂縫處伸出一條假根，透明伴有葉綠體，在發育過程中垂直于單裂縫方向伸長，偶見假根基部膨大或末端彎曲現象，這在蕨類孢子萌發中屬常見現象[17]; 絲狀體留存時間短，片狀體一般為匙狀，配子體多為雌雄同體，頸卵器為四面體，成熟精子器為圓球形。相比于不規則型的配子體來說，心型配子體更富有活力，較易觀察到幼孢子體的產生，一般從配子體腹部長出，隨著幼孢子體的生長，配子體逐漸凋零。

圖5 干旱環境下中華雙扇蕨的不規則型配子體(A～D)。Fo: 褶皺; Rh: 假根。

圖6 溫度和濕度對中華雙扇蕨孢子萌發率的影響。**: P<0.01。

雙扇蕨屬萌發方式均為型[10–11]，發育過程大致相似，但也存在些許差異。電鏡觀察表明，與雙扇蕨孢子不同，中華雙扇蕨孢子中有透明孢子和黃綠色孢子，數量相當，這在之前的研究中未見報道。黃綠色的孢子內部可能含有葉綠體，即綠色孢子，這種類型的孢子僅存在幾個相互無關聯的科和屬中，或者部分孢子外殼為黃綠色。有人認為綠色孢子相較于非綠色孢子的壽命更短，萌發更快, 就像不耐干燥和貯藏的頑拗性種子[18–19]。Sandip-kuamr[11]報道喜馬拉雅雙扇蕨孢子在保存45 d后喪失萌發活力，而新鮮孢子萌發能力則很強，中華雙扇蕨孢子的表現與之相同。最近的研究指出綠色孢子也具有干燥耐性，節節草()[20]、沼生木賊()[21]、歐紫萁()和莢果蕨()[22]的孢子在合適的儲存方式下能延長孢子壽命。

在不利的環境下，與其同屬蕨類不同的是，中華雙扇蕨配子體會涌現乳突毛狀體，而乳突毛狀體被認為具有增強反光、抗旱、抵御昆蟲啃食的能力[1]，但現今未有毛狀體作用機制的相關解釋。另外，不利環境抑制了雌雄同體的配子體形成，其中，雙扇蕨會產生許多精子器，并且有細長頸卵器，其頸部由7～9層細胞組成[10]，而中華雙扇蕨偏向產生更多的頸卵器，兩者的頸卵器發育均與薄囊蕨類相同[1]。中華雙扇蕨萌發趨于原始類型，以板塊或團塊狀萌發，與紫萁科、里白科(Gleicheniaceae)相似[23–24]。然而，與系統發育樹上最近的水龍骨科的萌發方式不同，水龍骨科發育方式有型和型[25]。這表明中華雙扇蕨孢子萌發方式雖表現為原始類型，但黃綠色的孢子，乳突毛狀體等現象的發生，說明中華雙扇蕨處于較進化的位置,其配子體應具有一定的抗逆性。

3.2 濕度影響中華雙扇蕨孢子萌發

中華雙扇蕨孢子萌發類型屬于型。在無菌培養中約20～25 d開始萌發，在不含任何營養物質的無菌水中也可萌發，說明中華雙扇蕨孢子萌發要求不高，萌發能力強，不存在任何休眠期，因此，中華雙扇蕨孢子的萌發特性不會導致其野外種群更新困難。而在不同溫度、濕度和凋落物濃度培養條件下，溫度對中華雙扇蕨孢子萌發并沒有影響，然而，濕度對孢子萌發有顯著影響。首先，干旱環境下孢子不能順利完成吸脹吸水過程。而中華雙扇蕨恰巧在旱季(9月至次年1月份)產生孢子，降雨少，土壤極干，向下挖掘30 cm也不見潮濕的土壤，這可能是中華雙扇蕨野生孢子實生苗少的原因之一。其次，中華雙扇蕨的孢子遭遇長時間缺水可能引起其內部結構的變異、損壞，而無法開始萌發。

蕨類孢子的萌發機制遵循與種子相同的原理[26]。大多數蕨類孢子吸水后體積變大，內部親水物質吸引水分子，代謝活動增強，啟動一系列生理反應。然而，有研究表明僅10%的蕨類物種具有較好的耐干旱性[27]。蕨類孢子在遭遇干旱時，孢子細胞體積減小[28]，細胞原生質或脂質體從流體結構變成固體結構[29]，Walters[30]認為細胞在干燥環境中容易處于不穩定狀態，極易超過細胞體積的最小閾值。相關研究也表明，固體結構中因分子的聚集阻礙了分子遷移速率，細胞基質可能喪失生存活力[31–33]。

3.3 干旱環境下中華雙扇蕨配子體褶皺增加

中華雙扇蕨配子體在適宜環境下可以順利發育出性器官并完成受精，干旱條件下的中華雙扇蕨配子體的體型變大，形狀不規則化，假根增生，性器官數量比例分配不均。據此，我們猜測中華雙扇蕨的配子體具有一定耐旱性，其復雜的形態可短暫地抵抗干旱。不同于種子植物通過增厚葉片，改變葉片角度等方式來減少水分蒸發，抗旱能力較強的蕨類配子體通常具有復雜的形態[34]。Watkins[35]研究發現蕨類配子體復雜多變的褶皺可能在干燥生境中對物種的生存起著重要作用。水龍骨科、骨碎補科(Davalliaceae)、條蕨科(Oleandraceae)等蕨類種群多達60%～70%為附生或干旱陸生物種，大多數配子體形態復雜多變，褶皺重疊彎曲[35]，從而形成微小空間的高濕空氣，延長并保持了濕潤和光合作用的時間[36]。Pittermann等[37]報道短葉風鈴草()復雜形態配子體的干燥速度遠慢于具有簡單形態的陸生植物糠秕藻()。因此, 我們推測中華雙扇蕨配子體在遭遇干旱或缺乏自由水的情況下，通過豐富其配子體形態變化和生理活動調節來獲得存活和完成受精的機會，還需進一步的實驗觀察證據。

中華雙扇蕨的瀕危原因包括生境脅迫、孢子萌發受阻和配子體發育畸形3個方面。歷史時期中華雙扇蕨由于古氣候的重大變化和地質活動使得該蕨生境面積狹窄，呈零星分布；而在惡劣(干旱)的環境下，孢子難以萌發或配子體形態畸變導致其生存與擴繁的機會渺茫，種群數量不易增加，種群更新困難。孢子繁殖對于蕨類種群擴張和更新是極其重要的途徑。因此，對中華雙扇蕨實施就地保護過程中，可以在孢子萌發季節通過噴灌改善其萌發條件。在遷地保護時，營造濕潤的生境很重要。當然，還可結合人工分株繁殖和人工孢子繁殖方法幫助育苗用于園林綠化。而針對瀕危蕨類物種，應對其生境特點、孢子特性、配子體發育規律和繁殖生物學等進行系統研究來制定科學高效的保護措施。

致謝 感謝黃耀、周婉敏同學在野外采樣工作中的幫助；感謝中國科學院華南植物園公共實驗室胡曉穎老師在電鏡觀察實驗中的悉心教學；感謝哈爾濱師范大學劉保東教授提供的幫助。

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Effects of Environmental Factors on Spore Germination of

OUYANG Kangting1,2, PANG Jinhui2, YU Xiaoling3, XU Zhanhui1,2, REN Hai1,2*, WANG Faguo1,2*, MA Guohua1, LIU Zongjun4, HU Mingfeng4, ZHANG Yajian4, TAN Guangwen5

(1. Guangdong Provincial Key Laboratory of Applied Botany, South China Botanical Garden, Chinese Academy of Sciences,Guangzhou 510650, China; 2. University of Chinese Academy of Sciences,Beijing 100049, China; 3. Zhongkai University of Agriculture and Engineering,Guangzhou 510650, China; 4. Guangdong Nanling National Nature Reserve Administration,Shaoguan 512727, Guangdong, China; 5. Pubang Landscape Architecture Co., Ltd,Guangzhou 510600, China)

To understand the endangered reasons of, a rare and endangered plant, the effects of temperature and humidity on spore germination was studied. The results showed that the spore germination ability was strong, with-type germination mode and-type gametophyte germination. The spore propagation ofwas not affected by temperature, while significantly influenced by humidity. The spores germinated normally in humid condition, forming heart-type gametophytes, and producing young sporophytes successfully. However, spores could not germinate under drought condition, gametophytes were inclined to irregularly development and folds increased. Therefore, the obstacles in spore reproduction ofunder unsuitable environment might be one of the reasons leading to the decline of wild population, so thatandconservation of these rare and endangered plants should pay attention to creating moist habitats.

; Environmental factor; Tissue culture; Gametophyte; Morphological development

10.11926/jtsb.4422

2021-04-08

2021-07-05

廣東省科技計劃項目(2019B121202006); 廣東省野生動植物保護管理項目資助

This work was supported by the Project for Science and Technology in Guangdong (Grant No. 2019B121202006), andthe Project for Wildlife Protection and Management in Guangdong.

歐陽康婷，女，碩士研究生，主要從事園林種質資源開發與利用研究。E-mail: 865970586@qq.com

. E-mail: renhai@scbg.ac.cn, wangfg@scbg.ac.cn