分子印跡柱結合液相色譜-串聯質譜法測定豬肌肉中4 種β-受體激動劑

宋世文，宋曉儀，梁 幸，唐淑軍，曾定玲，文冠希

（深圳市質量安全檢驗檢測研究院，廣東 深圳 518101）

β-受體激動劑是人工合成的苯乙醇胺類藥物，曾被用于動物飼料中以提高飼料的轉化率，增加動物胴體的瘦肉率［1］。含有β-受體激動劑殘留的動物性食品引起的食品安全事件已得到社會廣泛關注。中國明令禁止在動物飼養中使用或在產品中檢出此類藥物［2］。分子印跡技術（Molecular Imprinting Technology，MIT）作為一項新型技術，具有與天然生物分子識別的專一性，同時又具有良好的穩定性，被廣泛應用于樣品前處理過程［2］。

研究通過優化分子印跡固相萃取（MISPE）上樣、淋洗和洗脫溶劑的選擇等凈化條件及質譜條件，建立了快速檢測豬肌肉中克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇、西馬特羅等4種β-受體激動劑的MISPE-UPLCMS/MS 分析的混合樣品和單樣品方法。混合樣品法是利用其選擇性強和靈敏度高的特點，采用10 個單樣品組成混合樣品先進行篩選，再對陽性混合樣品進行單個檢測，方法有較低的檢出限和較高的精密度，在陽性率不高時，能對豬肌肉中克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇、西馬特羅進行準確的定性和定量分析。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

ACQUITY UPLC 超高效液相色譜（美國Waters公司）-QTRAP5500MS 串聯質譜儀（美國AB Sciex 公司）、固相萃取裝置、Oasis TM MCX 固相萃取柱（美國Waters 公司）；3-30K 臺式高速冷凍離心機（德國Sigma 公司）；Supel MIP SPE（β-agonists，25 mg/10 mL，65 μm，美國Sigma 公司）；Affinilute MIP-SPE（β-agonist，EU Biotage 公司，25 mg/10 mL）；J2 全自動固相萃取濃縮儀（美國J2 SCIENTIFIC 公司）。

甲醇、乙腈均為色譜純（德國Merck 公司）；甲酸為色譜純（北京迪馬科技有限公司）；乙酸為分析純（上海潤捷化學試劑有限公司）；乙二胺-N-丙基硅烷吸附劑（PSA），粒徑40～60 μm（美國Agilent Tech）；C18 粉，40 μm（美國Agilent Tech）。克侖特羅（Clenbuterol）、萊克多巴胺（Ractopamine）、沙丁胺醇（Sblbutamol）、西馬特羅（Bambuterol，純度＞98%）標準物質購自農業農村部環境保護科研監測所。

1.2 方法

1.2.1 標準溶液的配制 準確量取100 mg/L 標準物質，用甲醇定容配制1 mg/L 混合標準貯備液。準確量取1 mg/L 混合標準貯備液，配制分別為0.01、0.10、0.25、0.50、1.00、2.00、5.00、10.00 μg/L 的混合標準工作液。

1.2.2 液相色譜-質譜條件

1）色譜柱。Acquity LCBEH C18 柱（50 mm×2.1mm，17 μm，美國Waters 公司）；柱溫40 ℃；流速0.3 mL/min；進 樣 量5.0～10.0 μL；流動 相甲 醇（A）和0.05%（V/V）甲酸水溶液（B）。梯度洗脫程序：0～2.0 min，10%A～40%A，3.0～4.0 min，40%A～90%A；4.0～4.1 min，90%A，4.1～4.2 min，90%A～10%A，4.2～6.0 min，10%A。

2）離子源。電噴霧離子（ESI）源；正離子模式；多反應監測模式（MRM）；電噴霧電壓為正離子5 500 V；離子源溫度500 ℃；霧化氣為60 psi ，輔助加熱氣1為45 psi；輔助加熱氣2為50 psi；氣簾氣30 psi。

1.2.3 樣品準備

1）單樣品準備。取有代表性豬肌肉組成樣品300 g，先切成小塊，用高速組織粉碎機充分粉碎，冷凍備用。

2）混合樣品準備。將10 個備用的單樣品，每個取30.0 g，組成混合樣品，用高速組織粉碎機充分粉碎，冷凍備用。混合樣品檢測呈陽性的（≥LOQ），再對10 個單樣品進行檢測。

1.2.4 SPE 柱活化、上樣和洗脫過程

1）MCX 柱。依次用3 mL 甲醇和3 mL 水活化；然后樣品過柱；依次用3 mL 水、3 mL 甲醇水、3 mL甲醇清洗，用洗耳球擠干溶液；5 mL 5%氨水乙醇洗脫，用洗耳球擠干溶液。

2）MISPE 柱。依次用3 mL 乙醇、3 mL 水、3 mL 50 mol/L 乙酸銨（pH 6.7）活化；然后樣品上清液過柱；依次用3 mL 水、3 mL 乙腈、2 mL0.5%乙酸/乙腈溶液淋洗，用洗耳球擠干溶液；用5 mL 10%乙酸/甲醇溶液洗脫，收集洗脫液，用洗耳球擠干溶液。

1.2.5 樣品預處理 稱5.00 g混合樣（單樣品2.00 g）于50 mL 有蓋離心管，加入10 mL 50 mmol 乙酸銨（pH 6.7），10 000 r/min 勻漿2 min，強烈振蕩5 min，超聲10 min。10 000 r/min 離心6 min，取上清液9 mL，加300 mg PSA 粉和300 mg C18 粉，強烈振蕩3 min，放置5 min，取上清液8 mL 過柱。收集洗脫液，于50 ℃水浴下氮氣吹至近干，用0.5 mL 0.1%甲酸水/乙腈復溶，過0.22 μm 濾膜，待測。液相色譜進樣量混合樣品10 μL（5 μL 單樣品）。SPE 柱活化、上樣、洗脫和濃縮過程也可用J2 全自動固相萃取濃縮儀完成。

2 結果與分析

2.1 儀器條件優化

為提高4 種β-受體激動劑檢測的選擇性和靈敏度，優化檢測離子對的檢測條件，以達到較好穩定性和較高靈敏度的統一，4 種β-受體激動劑類藥物的保留時間及離子對優化質譜參數見表1。

表1 4 種β-受體激動劑類藥物的保留時間及離子對質譜參數

2.2 凈化效果比較

提取液組成復雜，含有脂肪、蛋白質和其他有機物質等雜質［2］。為提高凈化效果，首先用PSA 粉和C18 粉除去了一部分雜質，再用固相柱凈化。比較了Sigma-MIP、Biotage-MIP 與MCX 固相萃取的凈化效果，4 種β-受體激動劑在豬肌肉中的添加濃度為0.25 μg/kg，多樣品法測定，重復6 次，通過固相柱萃取凈化后，應用LC-MS 測定，得到4 種β-受體激動劑的信噪比（表2）。信噪比高，表示凈化效果好，檢出限低。由表2 可知，Sigma-MIP 固相萃取能有效消除豬肌肉提取液基質對4 種β-受體激動劑的影響，信噪比最高，其他2 種固相柱只有不到Sigma-MIP 的50%。用變異系數代表穩定性，變異系數低，表示穩定性高；變異系數高，表示穩定性差。由表2可知，Sigma-MIP 固相萃取對4 種β-受體激動劑的穩定性最優，其他2 種在138%和159%以上。綜合上述2 因素，選擇Sigma-MIP 凈化。

表2 3 種固相萃取柱凈化效果的比較

2.3 方法的定量限和線性范圍

單樣品法添加濃度為0.1、0.2、1.0、5.0、10.0 μg/kg；混合樣品法添加濃度為0.025、0.050、0.100、2.000、5.000 μg/kg；其中最低濃度（0.1 和0.025 μg/kg）重復6 次，其他濃度重復3 次。由表3 可知，該方法的定量限混合樣品法為0.025 μg/kg，單樣品法為0.1 μg/kg。該方法的定量限較國家標準（農業部公告1025號［3］，GB/T 22286—2008［4］）定量限LOQ更低，其中單樣品法定量限是國家標準的1/15～1/4。該方法檢定量低，可以作為多樣品混合檢測的依據。

表3 方法的定量限（與國家標準比較）和線性范圍

2.4 方法的回收率和精密度

單樣品法添加濃度為0.1、0.2、5.0 μg/L；混合樣品法添加濃度為0.025、0.050、2.000 μg/L；每個梯度重復6 次。4 種β-受體激動劑加標回收率和精密度結果見表4 和表5。不同加標濃度下，加標回收率為61.3%～97.7%；精密度4.6%～12.6%，方法表現出良好準確性和穩定性。

表4 不同添加濃度的單樣品添加回收率和精密度

表5 不同添加濃度的混合樣品添加回收率和精密度

2.5 方法應用效率

根據公開資料［5］，深圳市2019 年畜禽產品1—9月抽檢3 601 個樣品，檢測β-受體激動劑、磺胺、硝基呋喃等4 類20 個項目，發現超標樣品22 個，超標率0.61%。其中，β-受體激動劑超標率小于0.1% 。根據公開信息［6］，2021 年全國抽檢畜禽樣品22 127份，檢測項目18 項，總超標率1.2%，β-受體激動劑超標率小于0.1%。深圳市寶安區2018—2021 年4年共檢測畜禽產品384 個，檢測β-受體激動劑、磺胺、四環素類、喹諾酮類等5 類18 個項目，累計超標樣品15 個，超標率3.9%；超標樣品主要是四環素類和喹諾酮類，未見β-受體激動劑類物質超標。據農業農村部監測結果［7］，2017 年第三季度抽檢農產品共10 594 個，β-受體激動劑合格率99.8%。可見，β-受體激動劑超標率是比較少的，不到0.2%。

在實際檢測中，對超標率小于0.2%的情形，1 000 個單樣品，可以組成100 個混合樣品，由于陽性率小于0.2% ，只需2 個混合樣品重新檢測，所以相當于檢測1 000 個單樣，只需要檢測120 次（100 個混合樣和20 個單樣），該方法效率是常規方法檢測的8.3 倍。對超標率小于1%的樣品，100 個單樣品可以組成10 個混合樣品，共需檢測20 個樣品（10 個混合樣和10 個單樣品），效率是常規檢測的5 倍。因此該方法特別適用于超標率不高的大量樣品使用，效率是普通方法5～8 倍。