木棉花水提物的急性毒性試驗(yàn)

陳雯玲，楊 斌，謝仕源

（廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣西 南寧 530021）

木棉花（Kapok）又名班枝花、瓊枝、攀枝花，是木棉科植物木棉[Gossampinusmalabarica（DC.）Merr.]的花。藥性甘、淡、涼，具有保肝、抗腫瘤的作用，以及清熱、利濕的功效。木棉花主要產(chǎn)于云南、廣東等地[1]，是我國(guó)南方地區(qū)及東南亞國(guó)家民間常用藥材[2]。現(xiàn)代藥化、藥理研究表明[3，4]，木棉花富含黃酮、碳水化合物、甾醇、糖苷、生物堿、揮發(fā)油、酚類化合物，其保健價(jià)值較高，并且在安全性方面具有明顯的優(yōu)勢(shì)，其應(yīng)用前景廣闊。雖然目前已有文獻(xiàn)證明木棉花安全無(wú)毒[3]，但鮮有文獻(xiàn)報(bào)道木棉花水提物的最大用藥劑量。藥物需通過藥物毒理學(xué)研究來(lái)確定其安全性，而急性毒性試驗(yàn)是藥物毒理學(xué)研究的重要內(nèi)容之一。本試驗(yàn)探究最大濃度的木棉花水提物是否具有毒性，為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究確定木棉花水提物的用藥劑量提供重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF 級(jí)昆明小鼠32 只，雌雄各半，3～4 周齡，18～22 g。由廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心（許可證號(hào)碼：SYXK 桂2020-0003）提供實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK 桂2020-0004。并分籠飼養(yǎng)于動(dòng)物房，飼養(yǎng)環(huán)境溫度為24 ℃～26 ℃，其相對(duì)濕度為50%～60%，通風(fēng)性良好，每日光照盡量控制在12 h，晝夜交替。本實(shí)驗(yàn)已獲得廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，各項(xiàng)指標(biāo)均符合規(guī)定。

1.2 材料 木棉花干（廣西西林縣瑞桂吉純生態(tài)木棉有限公司）；電子天平（梅特勒-托利多上海公司，型號(hào)：AL204/01）

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 參考《中藥、天然藥物急性毒性試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則》和陳奇《中藥藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》，對(duì)木棉花水提物進(jìn)行急性毒性試驗(yàn)研究。

1.3.1 木棉花水提物的制備 用電子天平稱取適量木棉花干品，加8 倍量蒸餾水浸泡1 h 后補(bǔ)足至12倍量的水，常壓下回流提取2 次，2 h/次，合并2 次提取液進(jìn)行減壓濃縮至流浸膏，最終生藥量濃度為1.5 g/ml。

1.3.2 預(yù)實(shí)驗(yàn) 健康昆明小鼠6 只（雌雄各半），給藥濃度為含生藥量1.5 g/ml，灌胃體積0.4 ml/10 g 的木棉花水提物，每24 h 對(duì)小鼠進(jìn)行灌胃2 次，每次間隔12 h，1 d 內(nèi)的總給藥劑量為120 g/kg。給藥后觀察3 d，并常規(guī)飼養(yǎng)。觀察小鼠的毒性反應(yīng)，包括感覺、呼吸、運(yùn)動(dòng)、皮毛、眼瞼、進(jìn)食、糞便、死亡等，并對(duì)小鼠連續(xù)稱重7 d。結(jié)果發(fā)現(xiàn)小鼠在第1 次給藥后未出現(xiàn)異常，在第2 次給藥10 min 后，活動(dòng)稍微減少，4 h 后部分小鼠排出了干燥、黑硬的糞便；給藥第2 天小鼠進(jìn)食相對(duì)第1 天減少，但之后又快速恢復(fù)；給藥第3 天觀察結(jié)束時(shí)，未發(fā)現(xiàn)小鼠有死亡的情況，且反應(yīng)靈敏，活動(dòng)正常。表明給予以本實(shí)驗(yàn)制得的木棉花水提物以最大給藥量120 g/kg 時(shí)小鼠未出現(xiàn)明顯異常和死亡，且無(wú)法測(cè)得半數(shù)致死量（LD50）。因此，本實(shí)驗(yàn)采用最大給藥量的方法進(jìn)行試驗(yàn)。

1.3.3 正式實(shí)驗(yàn) 最大給藥量測(cè)定：選用健康小鼠32只，雌雄各半，按完全隨機(jī)法分為兩組，空白組及給藥組各16 只。適應(yīng)性生長(zhǎng)時(shí)間為2 d。給藥前禁食12 h，自由飲水。稱取給藥前小鼠的體重，隨后給藥。給藥組小鼠每次按照0.4 ml/10 g 體積和1.5 g/ml 生藥濃度給予木棉花水提物灌胃，每24 h 對(duì)小鼠進(jìn)行灌胃2 次，每次間隔時(shí)間控制為12 h，用藥劑量合計(jì)為120 g/kg。空白組小鼠每次按照0.4 ml/10 g 灌胃體積給予生理鹽水灌胃，灌胃的次數(shù)和給藥時(shí)間間隔同給藥組。給藥期間分別于第1、5、10、14 天稱取小鼠的體重。給藥后的小鼠正常飼養(yǎng)14 d 后處死小鼠。觀察小鼠的活動(dòng)、精神、攝食、排泄及死亡情況。觀察期間出現(xiàn)死亡小鼠及時(shí)進(jìn)行解剖，觀察其器官有無(wú)異常，并稱取空白組和給藥組小鼠的心、肝、脾、肺、腎和胸腺的濕重。計(jì)算其臟器指數(shù)，臟器指數(shù)=（臟器濕重/體重）×100%。

1.4 觀察指標(biāo) 觀察各組一般狀態(tài)及毒性表現(xiàn)，包括皮膚、被毛、眼睛、黏膜的改變，以及呼吸、循環(huán)、自主和中樞神經(jīng)系統(tǒng)、軀體運(yùn)動(dòng)及行為模式等變化發(fā)生時(shí)間、嚴(yán)重程度和持續(xù)時(shí)間，其觀察指標(biāo)出現(xiàn)的癥狀和涉及的系統(tǒng)，參考《中藥、天然藥物急性毒性試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則》，見表1。臟器觀察：所有動(dòng)物在試驗(yàn)終點(diǎn)時(shí)進(jìn)行大體解剖，包括檢查體表及體腔開孔、胸靜脈等，及時(shí)稱量各主要臟器，如：心、肝、脾、肺、腎、胸腺的濕重。

表1 急性毒性試驗(yàn)的一般觀察結(jié)果與可能涉及的組織、器官、系統(tǒng)

2 結(jié)果

2.1 一般觀察情況 每次給藥10 min 左右對(duì)試驗(yàn)小鼠進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)小鼠活動(dòng)相對(duì)稍減，4 h 后隨即恢復(fù)正常。在給藥的第2 天，小鼠的食量明顯下降，隨后又呈增長(zhǎng)趨勢(shì)；且無(wú)腹瀉等情況，其活動(dòng)、呼吸均為正常。給藥后小鼠外觀毛色依然光亮，無(wú)焦躁不安或精神萎靡的狀況出現(xiàn)；無(wú)豎毛，分泌物也未出現(xiàn)異常，無(wú)凸眼和扭體等反應(yīng)；攝食、飲水均正常。觀察期間小鼠未出現(xiàn)死亡的情況。

2.2 木棉花水提物對(duì)急性毒性試驗(yàn)小鼠體重的影響給藥期間兩組小鼠的體重雖均稍有波動(dòng)，但總體均呈增長(zhǎng)的趨勢(shì)。兩組第1、5、10、14 天體重分別比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表2、圖1。

圖1 木棉花水提物對(duì)急性毒性試驗(yàn)小鼠體重的影響

表2 木棉花水提物對(duì)急性毒性試驗(yàn)小鼠體重的影響（n=16，）

表2 木棉花水提物對(duì)急性毒性試驗(yàn)小鼠體重的影響（n=16，）

2.3 肉眼觀察解剖情況 給藥14 d 后將小鼠通過頸椎脫臼術(shù)處死，隨后對(duì)小鼠進(jìn)行大體解剖，并用肉眼觀察小鼠的心、肝、脾、肺、腎、胸腺，結(jié)果顯示，未出現(xiàn)出血、充血、水腫改變，見圖2。

圖2 木棉花水提物對(duì)急性毒性試驗(yàn)雌性小鼠臟器的影響

2.4 兩組臟器指數(shù)比較 兩組肝臟、脾臟、胸腺、心臟、肺、左腎、右腎指數(shù)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表3、圖3。

表3 木棉花水提物對(duì)急性毒性試驗(yàn)小鼠臟器指數(shù)的影響（，%）

表3 木棉花水提物對(duì)急性毒性試驗(yàn)小鼠臟器指數(shù)的影響（，%）

圖3 木棉花水提物對(duì)急性毒性試驗(yàn)雌性小鼠臟器指數(shù)的影響

3 討論

木棉花茶廣泛用于民間，我國(guó)居民常將其晾干后泡水服用或煲湯食用。廣東等地生產(chǎn)的五花茶涼茶，由木棉花與金銀花、菊花、雞蛋花、槐花配制而成，深受消費(fèi)者喜愛[5]。在我國(guó)南方木棉花最先主要作為中藥材使用，逐漸發(fā)展到藥用與食用并重，具有清熱解毒，祛風(fēng)除濕等功效，可治療發(fā)熱、痢疾、腹瀉和慢性炎癥等[6]。不僅如此，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，木棉花具有多種藥理活性，如抗氧化[7]、降糖[8]、抗炎鎮(zhèn)痛[9]、保護(hù)腎臟[10]、抗焦慮[11]、保護(hù)肝臟[12，13]、抗癌[14]、護(hù)胃[15]、心臟保護(hù)[16，17]、抗衰老[18]等作用。由此可見，木棉花不僅具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和保健作用，還具有一定的藥效。因此，木棉花的藥用價(jià)值顯而易見，故探究木棉花的藥物安全性作用顯得尤為重要。本試驗(yàn)通過最大給藥量的方法探究最大濃度的木棉花水提物是否具有毒性。在給藥的第2 天，小鼠的食量明顯下降，隨后又呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，其他觀察指標(biāo)無(wú)明顯異常，故食量下降推測(cè)為小鼠適應(yīng)的過程。在觀察小鼠體重變化過程中，通過對(duì)空白組和給藥組小鼠體重進(jìn)行分析，結(jié)果顯示兩組不同時(shí)間體重比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），說明木棉花水提物對(duì)小鼠體重變化無(wú)影響。給藥14 d 后，將小鼠大體解剖后用肉眼觀察重要臟器，結(jié)果未出現(xiàn)出血、充血、水腫改變，說明肉眼觀察木棉花水提物對(duì)小鼠的臟器無(wú)影響。兩組肝臟、脾臟、胸腺、心臟、肺、左腎、右腎指數(shù)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），說明木棉花水提物最大給藥劑量的情況下小鼠臟器指數(shù)無(wú)明顯改變。試驗(yàn)過程中無(wú)小鼠死亡，無(wú)法測(cè)得半數(shù)致死量，說明本試驗(yàn)中的木棉花水提物，在給予小鼠灌胃劑量為120 g/kg 時(shí)無(wú)明顯毒性。馮丁山等[6]將10 g 新鮮的木棉花，制成1 g 的木棉花干粉，通過急性毒性試驗(yàn)，得出在其試驗(yàn)劑量范圍內(nèi)對(duì)雌、雄小鼠的急性經(jīng)口最大耐受量（MTD）均＞80.00 g/（kg·BW），為實(shí)際無(wú)毒，從而證明木棉花對(duì)試驗(yàn)動(dòng)物未見明顯毒副作用。本研究結(jié)果與上述研究結(jié)果基本一致。

綜上所述，木棉花干水提物最大給藥劑量的情況下，口服無(wú)明顯毒性作用。