三種中藥提取物的體外抑菌及穩定性研究

王麗娜，馮紫艷

(許昌學院 食品與藥學院，河南 許昌 461000)

黃芩，又叫山茶根，是唇形科黃芩屬多年生草本根植物，具有抗炎、抗氧化、抗癌、抗病毒等藥理作用[1].黃芩苷、黃芩素是從黃芩根部提取出來的一種黃酮類化合物，是黃芩發揮藥效的關鍵成分[2].秦皮為木樨科植物苦櫪白蠟樹、白蠟樹、尖葉白蠟樹、宿柱白蠟樹的干燥枝皮.秦皮甲素為中藥秦皮的有效成分之一，具有抗炎作用[3].為了考查三種中藥提取物的體外抑菌及穩定性，通過研究黃芩苷、黃芩素和秦皮甲素對革蘭氏陰性菌大腸桿菌和革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌的體外抑菌試驗，分析溫度和pH對其抑菌穩定性的影響，為聯合用藥研究打下理論基礎.

1 材料與儀器

1.1 藥品和材料

黃芩苷：植物提取物有限公司；黃芩素：由南京源植生物科技有限公司；秦皮甲素：南京源植生物科技有限公司；LB瓊脂平板：北京奧博星生物技術有限公司；無水乙醇：分析純，無錫市亞泰聯合化工有限公司；二甲基亞砜(DMSO)：天津科密歐；濾紙；打孔器；培養皿；涂布棒等.

1.2 菌種

金黃色葡萄球菌、大腸桿菌由實驗室提供.

1.3 儀器

MJ-54A高壓蒸汽滅菌鍋，師都凱儀儀器設備有限公司；SW-CJ-2FD超凈工作臺，蘇州凈化設備工程有限公司；SHP生化培養箱，北京中興偉業儀器有限公司.

2 試驗方法

2.1 藥液的制備

2.1.1 黃芩苷藥液的制備

稱取黃芩苷4.0 g，加入50 mL容量瓶中用無菌水定容，制成80 mg·mL-1的母液備用.

2.1.2 黃芩素藥液的制備

稱取4.0 g黃芩素，加入50 mL容量瓶中用60%乙醇定容，制成80 mg·mL-1的母液備用.

2.1.3 秦皮甲素藥液的制備

準確稱取4.0 g秦皮甲素，加入50 mL容量瓶中，用二甲基亞砜定容，制成80 mg·mL-1的母液備用.

[44]Dong Huk Park, et al., “Attentive Explanations: Justifying Decisions and Pointing to the Evidence”, https://arxiv.org/pdf/1612.04757v1.pdf.

2.2 菌懸液的制備

挑選用斜面培養16 h左右正處于對數生長期的菌體，放入有玻璃球的無菌生理鹽水中，充分混勻，用傾注平板法測定菌落總數，使其濃度在104～106CF6U/mL，備用[4].

2.3 藥敏片的制備及抑菌活性的測定

取定性濾紙，用打孔器打成6 mm直徑的圓形小紙片，將濾紙片放入培養皿中，經高壓滅菌后放入干燥器，干燥后備用.制備LB平板，做標記.分別取金黃色葡萄球菌、大腸桿菌兩種待測菌懸液100 μL，接種于相應培養基平板上，涂布棒涂布均勻后即制備好帶菌平板.將制備好的無菌濾紙片(6 mm)分散平放在平板上，再在濾紙片上分別滴加10 μL由2.1制備的藥液的母液，以藥液的相應溶劑作空白對照.在37 ℃恒溫培養箱中培養24 h后，使用游標卡尺并采用十字交叉法測量抑菌圈直徑.每組試驗各做三個平行，取其平均值[5].

2.4 最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)的測定

采用二倍稀釋法將三種藥液進行稀釋，制成40，20，10，5，2.5，1.25 mg·mL-1等不同濃度的藥液.制備LB平板并進行編號.各取100 μL兩種供試菌菌懸液分別滴加在相應編號的LB平板上并涂布均勻，在平板上分散放置無菌濾紙片，滴加不同濃度的藥液10 μL，在37 ℃的恒溫培養箱中培養24 h.采用交叉法測量不同濃度藥物的抑菌圈直徑，確定最小抑菌濃度.確定MIC后將平板繼續培養24 h，再次測定抑菌圈直徑，確定相應物質的最低殺菌濃度.

2.5 抑菌穩定性研究

2.5.1 溫度對3種中藥提取物穩定性的影響

將40 mg·mL-1的藥液分別置于20，40，60，80，100 ℃的水浴鍋中保溫15 min，然后在121 ℃的高壓滅菌鍋中保持15 min，自然冷卻至室溫備用[6].

在已經做好標記的LB平板上分別滴加對應的供試菌菌懸液100 μL，用涂布棒涂布均勻后，將滅菌過的濾紙片分散平放在帶菌平板表面，在每個濾紙片上分別滴加10 μL藥液，這些藥液分別經過20，40，60，80，100，121 ℃熱處理過，未經高溫處理過的藥液作為對照組.在37 ℃的恒溫培養箱中倒置，培養24 h后測量抑菌圈直徑.每組試驗各做三個平行樣，取其平均值.比較不同溫度對各種藥物抑菌活性的影響.

2.5.2 pH對3種中藥提取物穩定性的影響

分別用0.1 mol·L-1的HCl和0.1 mol·L-1NaOH溶液調節培養基的pH，滅菌后的培養基制成pH分別為4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0的LB平板.用濾紙片法檢測不同pH的環境對三種藥物抑菌性的影響，每種藥物做三個平行樣，取其平均值[7].

3 試驗結果

3.1 抑菌活性的測定結果

表1 80 mg·mL-1的黃芩苷、黃芩素、秦皮甲素的抑菌圈直徑/mm

3.2 最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)的測定

根據2.4進行試驗，最小抑菌濃度(MIC)試驗結果見表2、表3、表4.可以看出，黃芩苷、黃芩素、秦皮甲素對大腸桿菌的最小抑菌濃度分別為40，2.5，20 mg·mL-1；對金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度則分別為5，2.5，10 mg·mL-1.確定MIC后將平板繼續培養24 h，再次測定抑菌圈直徑，確定黃芩苷、黃芩素、秦皮甲素對大腸桿菌的最小殺菌濃度分別為40，5，20 mg·mL-1；對金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度則分別為5，5，20 mg·mL-1.

表2 黃芩苷藥液的抑菌結果(MIC)

表3 黃芩素藥液的抑菌結果(MIC)

表4 秦皮甲素藥液的抑菌結果(MIC)

3.3 溫度對3種中藥提取物穩定性的影響的結果

根據2.5.1進行試驗，實驗結果如圖1所示.可以看出，黃芩苷對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌作用與20 ℃下的抑菌結果相近，溫度對黃芩苷的影響較小.黃芩素對大腸桿菌的抑菌作用在40～80 ℃的抑菌效果與20 ℃差別不大；溫度在100 ℃時抑菌效果略有下降，溫度為121 ℃時則下降明顯.秦皮甲素對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌在40、60、80 ℃的抑菌效果與20 ℃相比有所提升，在100 ℃和121 ℃的抑菌效果有所下降，但變化不明顯.

圖1 溫度對三種中藥提取物抑菌穩定性的影響

3.4 pH值對3種中藥提取物穩定性影響的結果

根據2.5.2進行試驗，不同pH值對3種藥物提取物抑菌活性的影響結果如圖2所示.可以看出，隨著介質的pH值升高，黃芩苷無論是對金黃色葡萄球菌還是對大腸桿菌抑制能力都是在酸性環境下較好，而且隨著pH值增高，抑菌活性明顯下降.這與QIU F等[8]的研究，結果一致，這可能是堿性環境下破壞了黃芩苷的活性物質.黃芩素對兩種菌的最適的抑菌pH值均為6，偏酸時抑菌影響不顯著，偏堿性環境，特別是pH值為10是影響較為明顯.秦皮甲素最好的抑菌pH值為偏堿性,pH值在8～9時的抑菌效果較好，原因可能是酸性和強堿性環境會影響秦皮甲素的活性.

4 結語

試驗結果表明對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌抑菌效果最好的均為黃芩素.黃芩苷熱穩定性較好，在121 ℃以下比較穩定;黃芩素和秦皮甲對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果受溫度影響較大.黃芩苷和黃芩素在偏酸性環境中抑菌活性較好，秦皮甲素在偏堿性環境中抑菌效果較好.

只是對三種藥物的抑菌情況及其穩定性進行實驗，將來要對其穩定性變化的原因加以研究.另外，這僅僅是單一藥物試驗，以后要進一步進行聯合用藥試驗.

圖2 pH對三種中藥提取物抑菌穩定性的影響