潰瘍性結腸炎中巨噬細胞差異基因及功能分析

陳夢雪 王宏剛 謝 睿

江蘇省淮安市第一人民醫院消化內科，江蘇淮安 223300

潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種病因不明的腸道炎癥性疾病，近年來發病率持續上升[1-2]。隨著高通量測序技術發展，單細胞測序（single-cell sequencing，SCS）被用于UC 的發病機制研究。SCS 評價腸道組織的單個細胞異質性，能更準確地解析各類細胞參與的腸道炎癥過程[3-4]。

Boland 等[5]對UC 患者的直腸黏膜組織進行SCS分析，發現巨噬細胞與UC 的發生發展密切相關[6]。本研究挖掘SCS 數據[5]，篩選UC 與非UC 患者腸道巨噬細胞的差異基因，分析參與的生物學功能和信號通路，從固有免疫細胞角度討論UC 的發病機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本研究原始數據來自數據集GSE125527。選取2019 年1 月至12 月前往the VA San Diego 醫療機構就診的7 例UC 患者和7 名健康對照者的直腸黏膜作為對照SCS 數據進行分析。UC 組納入標準：處于疾病活動期的UC 患者。對照組納入標準：行結腸鏡篩查的非腸炎人群。排除標準：直腸型UC；合并明顯腸道并發癥或感染；合并惡性腫瘤；肝腎功能不全[4]。UC 組平均年齡（43.3±13.6）歲；男3 例，病程中位數為6 年；女4 例，病程中位數為9 年；病變范圍為左半結腸1 例，全結腸6 例。Mayo 內鏡評分為輕度1 例，中度5 例，重度1 例[7]。對照組平均年齡（48.1±17.8）歲；男5 例，女2 例。

1.2 研究方法

1.2.1 質控及篩選細胞 計算每個細胞中nFeature-RNA。過濾掉基因數目＞2500、＜200 及超過5%的線粒體占比的細胞。

1.2.2 鑒定差異基因 使用vst 方法計算細胞與細胞之間的差異基因。以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

1.2.3 聚類分析 進行數據標準化，基于篩選好的主成分對細胞進行聚類。

1.2.4 基因本體論（gene ontology，GO）功能和京都基金和基因組數據庫（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）信號通路富集分析 采用cluster Profiler R 包對巨噬細胞的標記基因進行功能富集和信號通路富集分析。富集分析基于超幾何分布原理。

2 結果

2.1 聚類分析結果

獲得了15 個聚類的細胞群，不同類的細胞群標記為不同的顏色，分別用cluster 0 至14 表示。見圖1。

2.2 巨噬細胞識別

CellMarker 數據庫檢索到143 個人的巨噬細胞標記基因。與cluster 對應的基因進行交集，有19 個巨噬細胞的標記基因屬于cluster 11，分別為CD68、CD14、CD86、LYZ、TREM1、MS4A7、MXD1、SPINT2、PLBD1、CSF1R、FGR、FAM49A、CYBB、DSE、MS4A6A、SAMHD1、CIITA、TGFBI、AIF1，所以識別cluster 11 為巨噬細胞。

2.3 差異基因篩選

將兩組巨噬細胞進行基因表達量分析，共篩選出31 個顯著差異基因。按照差異倍數（對照/UC）的對數值（logFC）由小到大排序，見表1。結果顯示，TIMP1、IFITM3、IGHG1 在UC 組顯著高表達。

表1 兩組巨噬細胞差異基因

2.4 GO 功能富集分析

包括生物過程（biological process，BP）、細胞組成（cellular component，CC）和分子功能（molecular function，MF）3 個方面。在BP 方面，差異基因富集于對氧化應激、對活性氧、對病原體的防御、體液免疫等反應。在CC 方面，主要富集于分泌顆粒內腔、胞質囊腔、囊腔等。在MF 方面，主要富集于酶抑制劑活性等。見圖2。

2.5 KEGG 信號通路富集分析

差異基因顯著富集于白細胞介素-17（interleukin-17，IL-17）、趨化因子、Toll 樣受體等信號通路。見圖3。這些信號通路是巨噬細胞炎癥調控的重要通路，提示巨噬細胞可能通過這些炎癥信號通路參與UC。

3 討論

UC 是多種免疫細胞參與的慢性腸道炎性疾病[8]，發病的免疫學機制逐漸被深入研究。SCS 較多應用于腫瘤研究[9]，在UC 中少有報道。Boland 等[5]對7 例UC患者的直腸黏膜組織行SCS 分析，提出適應性免疫細胞在UC 中的作用機制。但是，以巨噬細胞為代表的固有免疫細胞是否參與UC 尚未充分闡述。

巨噬細胞常駐于腸道固有層，維持腸道穩態，在病原體感染、炎癥反應、免疫激活等方面起著重要作用[10-11]。UC 腸道微環境中，巨噬細胞的分化過程受到干擾，過多分泌促炎因子，加重UC 進展[12-13]。因此，應用SCS 分析UC 患者的腸道巨噬細胞功能有重要意義。

本研究比較UC 組和對照組巨噬細胞基因轉錄水平，篩選出31 個差異基因。其中，TIMP1、IFITM3、IGHG1 在UC 組巨噬細胞中顯著高表達。本研究認為腸道巨噬細胞的這3 個基因可能與UC 密切相關。TIMP1 是基質金屬蛋白酶的抑制酶，參與腫瘤、炎癥等過程[14-15]。吳娜等[16]通過生物信息學分析發現，TIPM1 是活動期UC 的關鍵因子。IFITM3 是一種固有免疫系統反應蛋白，被認為是免疫開關，可能增加結腸癌風險[17]。IGHG1 是免疫球蛋白重鏈編碼基因，參與腫瘤免疫過程[18-19]。因此，這3 個基因可能是參與UC 異型增生甚至癌變的相關因子。既往研究發現，廣泛結腸型和年齡大是我國UC 患者發生異型增生的2 個獨立危險因素[20-21]。對結腸炎癥范圍廣和年齡較大的高危人群進行腸黏膜活檢，檢測這3 個基因的表達從而預測異型增生，未來可能用于臨床監測UC 癌變。

氧化應激可導致促炎巨噬細胞的結腸浸潤，加重結腸炎[22]。Galectin-1 通過抑制炎癥和氧化應激，降低了葡聚糖硫酸鈉誘導的UC 的嚴重程度[23]。去除氧自由基，減少氧化應激，有助于UC 恢復。另外，IL-17 可分泌Th17 細胞、巨噬細胞等，參與腸道炎癥。然而，關于IL-17 信號通路在UC 中的抗炎或促炎作用尚存爭議。有研究報道，活動期UC 患者的腸黏膜和血清中IL-17 的水平升高，與UC 臨床嚴重程度呈顯著相關，但抑制IL-17 并不能有效誘導UC 緩解[24]。在動物研究中，敲除IL-17 后，小鼠的結腸炎癥顯得更加嚴重[25]?？梢?，IL-17 在UC 中顯示出高度復雜性。

綜上，本研究篩選出UC 患者腸道巨噬細胞的差異基因，且巨噬細胞的氧化應激和IL-17 信號通路可能參與UC 疾病過程，這將為進一步研究UC 發病機制提供依據。