網絡藥理學與分子對接分析槲皮素治療肝癌的分子機制△

秦中強，談燚，張蘭，譚玉林#

蚌埠醫學院第一附屬醫院1介入科，2肝膽外科，安徽 蚌埠 233000

肝癌發病率居全球第六位，病死率居第四位，每年新發肝癌約84.1萬例，病死約78.2萬例[1]，給社會和家庭帶來了巨大負擔。手術切除仍是早期肝癌患者的首選治療方案，但由于各種原因，肝癌切除術后患者的5年復發率高達70%[2]。目前，尚沒有明確的輔助療法可供患者預防或減少術后轉移和新發腫瘤風險，肝癌切除術后患者的預后仍不理想。此外，肝癌患者在接受手術切除后，應激反應和相關免疫抑制機制被激活，可能導致腫瘤細胞轉移[3]。因此，尋找新的藥物延緩肝癌的發生發展、減少術后轉移風險是臨床研究的重點。

多酚類黃酮被廣泛認為是天然的、無毒的化學預防劑，這些多酚類物質多具有顯著的抗氧化、抗炎和抗腫瘤特性。槲皮素作為這些多酚類黃酮的主要代表，存在于水果、飲料和蔬菜中[4-5]，表現出卓越的抗氧化和抗腫瘤潛力[6]，從而吸引了相關研究者的注意。研究顯示，槲皮素在抑制肝癌細胞的氧化應激、轉移和促進凋亡等過程中發揮了一定的作用[7-8]。因此，肝癌治療過程中，槲皮素通過哪些具體的通路抑制腫瘤的發生發展值得進一步研究。目前，在藥物和疾病間具體通路機制的研究中，網絡藥理學作為一種新型的研究方法發揮了重要的作用。本研究基于網絡藥理學與分子對接技術，探討槲皮素治療肝癌的核心基因和具體的分子機制，以期為基礎研究、臨床藥物研發提供新思路，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 槲皮素靶點的獲取

通過中藥系統藥理學分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology，TCMSP）（http://tcmspw.com/）和 PharmMapper數據庫（http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/），以“quercetin”為關鍵詞檢索槲皮素的作用靶點，靶點種類設定為human protein，其他默認[9-10]。檢索日期截至2021年6月1日。

1.2 肝癌相關靶點的獲取

通過CTD數據庫（http://ctdbase.org）和Gene-Cards數據庫（https://www.genecards.org/），以“liver cancer”為關鍵詞檢索相關基因[11-12]。將檢索到的肝癌相關靶點合并，剔除重復項，獲得肝癌相關靶點。

1.3 槲皮素與肝癌交集靶點蛋白質互作（proteinprotein interaction，PPI）網絡的構建

將通過篩選的相關靶點上傳至在線韋恩圖（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/），得到槲皮素與肝癌的交集基因，并將其導入String數據庫（https://string-db.org/cgi/input.pl）[13]，構建蛋白質之間的PPI網絡。交集基因導入Pather數據庫得到交集靶點功能分類，將PPI網絡導入Cytoscape3.7.2軟件（http://www.cytoscape.org/）進行調整，并利用CytoHubba插件得到關鍵靶點。

1.4 GO、KEGG分析和槲皮素-主要通路-肝癌網絡構建

為進一步了解交集基因的功能及其在信號通路中作用，使用R語言包對交集基因進行基因本位（gene ontology，GO）分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）分析，同時構建槲皮素-主要通路-肝癌核心靶點網絡。

1.5 槲皮素與肝癌分子對接

將已知的肝癌關鍵靶點與槲皮素進行分子對接，得到對接親和力以反映其穩定性。通過蛋白質結構數據庫（Protein Data Bank，PDB）下載肝癌的核心蛋白分子結構，PubChem數據庫下載槲皮素的結構，將蛋白和槲皮素結構導入PyMol 2.4.0和Auto Dock Tools軟件處理后，進行分子對接，采用PyMol 2.4.0軟件進行可視化分析[14-15]。

2 結果

2.1 槲皮素潛在靶點信息

通過TCMSP、PharmMapper數據庫最終得到槲皮素的潛在靶點共380個，將靶點名稱上傳至UniProt數據庫并校正靶點名稱，剔除得分較低的靶點，最終得到361個靶點。

2.2 肝癌相關靶點信息

通過CTD、GeneCards數據庫共篩選出50 459個基因，其中CTD數據庫33 725個，GeneCards數據庫16 734個，通過篩查剔除CTD和GeneCards中關聯得分較小的基因，分別篩選出631、524個關聯得分較高的基因，將其合并剔除重復基因，得到995個高分靶點。

2.3 槲皮素-肝癌的交集靶點信息

將槲皮素潛在靶點信息與肝癌高分靶點取交集，得到槲皮素中與肝癌相關的127個作用靶點基因，包括TP53、caspase 8、表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）、轉甲狀腺素（transthyretin，TTR）、促分裂原活化的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）等。通過Panther數據庫將槲皮素治療肝癌的127個相關靶點分為7類，主要功能包括催化活性（38.5%）、結合（36.2%）、分子功能調節（17.8%）等。

2.4 槲皮素治療肝癌相關靶點的PPI網絡

將交集靶點導入String數據庫，得到PPI網絡，將其導入Cytoscape進行可視化分析，網絡中共127個節點，2512條邊，利用CytoHubba插件得到排名前10的肝癌治療相關核心靶點分別為TP53、蛋白激酶 1（threonine kinase 1，AKT1）、myc、caspase 3、血管內皮生長因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、AP-1轉錄因子亞單位（AP-1 transcription factor subunit，JUN）、白細胞介素（interleukin，IL）-6、MAPK8、EGFR和MAPK1。（圖1）

圖1 槲皮素治療肝癌相關靶點的PPI網絡

2.5 GO功能分析結果

槲皮素治療肝癌的GO功能結果顯示，生物過程主要集中在腺體發育、凋亡信號通路調控和脂多糖應答等；細胞組成主要集中在膜筏、膜微區和膜區等；分子功能主要集中在DNA-轉錄因子結合、RNA聚合酶Ⅱ-特異性DNA轉錄因子結合、泛素樣蛋白連接酶結合等。（圖2）

圖2 GO功能分析結果

2.6 KEGG通路富集分析結果

KEGG通路富集篩選結果共173個富集項，其中前30個最具有顯著性的通路見圖3，其中脂質和動脈粥樣硬化、磷脂酰肌醇-3-羥激酶（phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，PI3K）/蛋白激酶 B（protein kinase B，PKB，又稱AKT）信號通路、乙型肝炎、腫瘤中的蛋白多糖和MAPK信號通路等均可能為重要的通路。

圖3 KEGG通路富集分析結果

2.7 分子對接分析

將槲皮素與肝癌關鍵靶點進行分子對接，平均對接親和力為-6.58 kcal/mol，對接親和力絕對值越大結合越穩定，表明槲皮素與肝癌核心靶點有較強的結合力。（表1）

表1 槲皮素與肝癌治療相關靶點的對接結果

3 討論

肝癌以臟腑氣血虧虛為本，氣、血、濕、熱、瘀、毒互結為標，蘊結于肝，漸成癥積，肝失疏泄為基本病機。Hisaka等[16]研究發現，槲皮素具有抑制肝癌細胞增殖的作用。已有研究表明，槲皮素可通過阻斷caspase/Cyto-c通路和阻斷AKT/細胞外信號調節激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）1/2信號通路的表達，抑制肝癌細胞增殖并促進其凋亡[17]。

本研究結果顯示，槲皮素可能通過127個靶點治療肝癌，通過Panther數據庫分析后發現交集靶點主功能主要集中于催化活性、結合和分子功能調節。經過PPI網絡分析發現，治療的關鍵靶點為TP53、AKT1、myc、caspase 3和VEGFA等，其中TP53可根據生理環境和細胞類型誘導細胞生長停滯或凋亡。Mao等[18]研究發現，薯蕷皂苷通過調節p53基因引導細胞凋亡、自噬和DNA損傷，對體外和體內的肝癌表現出強大的作用。AKT1是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶中的一種，主要參與細胞代謝、增殖和凋亡等過程。異常的AKT1在糖尿病、心血管疾病和各種腫瘤中有激活作用[19]。myc可抑制前列腺素E2受體的表達，進一步阻斷EP4R/c-myc通路的表達，從而抑制肝癌細胞的增殖和遷移[20]。caspase 3主要在凋亡早期及凋亡晚期中發揮作用，國內研究發現，靶向藥物聯合caspase 3可進一步抑制肝癌細胞增殖并促進其凋亡[21]。VEGFA具有促進增殖、遷移并抑制細胞凋亡的作用，抑制VEGFA的表達進一步減少肝癌細胞的侵襲、增殖和遷移[22]。本研究通過分子對接發現，槲皮素與上述肝癌治療關鍵靶點具有良好的結合力。

KEGG富集分析發現，槲皮素治療肝癌主要通路集中于脂質和動脈粥樣硬化、PI3K/AKT信號通路、乙型肝炎、腫瘤中的蛋白多糖和MAPK信號通路等。研究發現，miRNA-1271-5p通過靶向蛋白抑制肝癌細胞增殖、遷移和侵襲過程，誘導腫瘤細胞凋亡，體外減輕乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染，并在體內抑制腫瘤生長[22]。Rahmani等[23]研究發現，肝癌患者中PI3K/AKT通路的激活與肝癌細胞的生長有關。汪丹丹等[24]發現，通過藥物激活肝癌細胞中的PI3K/AKT通路，可抑制肝癌細胞的凋亡、遷移和增殖等過程。MAPK信號通路的主要作用為調節細胞生長、分化和凋亡[25]。肝癌發生發展過程中，MAPK通路主要參與細胞增殖、遷移與凋亡。通過miRNA-127轉染肝癌細胞可阻斷MAPK通路的表達，明顯抑制肝癌細胞的體內體外增殖、遷移并促進其凋亡。槲皮素參與治療腫瘤的重要通路包括蛋白多糖、MAPK信號通路和PI3K/AKT信號通路。GO分析中，生物過程主要集中在腺體發育、凋亡信號通路的調控、對脂多糖應答等，與上述通路介導的生物學過程相符合。

綜上所述，槲皮素治療肝癌的核心靶點為TP53、AKT1、myc、caspase 3、VEGFA等。GO 分析生物過程主要集中于腺體發育、凋亡信號通路的調控等；KEGG分析主要治療通路集中于脂質和動脈粥樣硬化、PI3K/AKT信號通路、乙型肝炎、腫瘤中的蛋白多糖和MAPK信號通路。分子對接提示，槲皮素與肝癌治療核心靶點均有較好的結合能。以期為臨床上治療肝癌以及基礎研究提供了新的治療藥物和研究方向。