血清let- 7 a水平對喉癌手術患者預后的預測價值

陳皓，張珂，李紅娟

安陽市第六人民醫院耳鼻喉科，河南 安陽 455000

喉癌是指發生于喉部上皮的惡性腫瘤，其早期臨床表現為聲音沙啞、咽喉異物感、血痰等[1]。喉癌約占全身惡性腫瘤的8.0%，手術是喉癌直接而有效的治療方法，雖然近年來手術聯合放療、化療和生物治療等綜合治療方法使喉癌患者的近期預后有所改善，但其遠期生存率并未獲得有效提高[2]。研究顯示，喉癌手術患者的3年生存率為71.79%，5年生存率僅為57.69%，一旦出現頸部淋巴結轉移，其生存率將會大大下降[3]。微小RNA（microRNA，miRNA）是一類內源性小分子非編碼RNA，與腫瘤的發生和發展密切相關[4]。let-7a作為miRNA中的重要一員，可與原癌基因ras、高遷移率族蛋白A2、c-myc的3'末端非翻譯區相結合，抑制靶基因的轉錄和翻譯，從而抑制腫瘤生長、侵襲和轉移等生物學過程[5]。研究發現，let-7a水平在肝癌、口腔癌和食管癌等惡性腫瘤組織中均顯著降低[6-8]。也有研究顯示，喉癌患者血清let-7a水平顯著下調，且let-7a水平與淋巴結轉移有關，表明let-7a有助于喉癌的早期診斷和術后病情監測[9]。但是有關血清let-7a水平對喉癌手術患者預后預測價值的研究鮮見報道。本研究通過分析85例喉癌手術患者的臨床資料，旨在探討血清let-7a水平對喉癌手術患者預后的預測價值，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2015年6月至2017年6月于安陽市第六人民醫院接受手術治療的喉癌患者。納入標準：①經術后病理檢查確診為喉癌；②術前未接受放療、化療及免疫治療；③隨訪3年或術后3年內因喉癌進展而死亡；④臨床資料完整。排除標準：①合并其他惡性腫瘤；②具有風濕免疫相關疾病病史；③未按照醫囑正規治療或因復發而再次手術。依據納入和排除標準，本研究共納入85例患者。其中，男48例，女37例；年齡35～80歲，平均（54.50±7.61）歲；根據第8版國際抗癌聯盟（Union for International Cancer Control，UICC）TNM分期系統進行分期[10]：Ⅰ期25例，Ⅱ期37例，Ⅲ期16例，Ⅳ期7例。根據術后3年內是否死亡將患者分為死亡組（n=21）和生存組（n=64）。本研究經醫院倫理委員會審批通過，所有患者均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 資料收集及let- 7 a水平檢測

收集患者的性別、年齡、腫瘤類型、分化程度、T分期及TNM分期等臨床資料。采用無RNA酶的離心管收集患者的血液樣本5 ml，3000 r/min離心10 min，靜置0.5～1.0 h待樣本全部凝固。吸取1.5 ml上清液置于新的無RNA酶的離心管中，-80℃保存待檢，所有標本均在2個月內完成檢測。采用實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）檢測血清let-7a水平。按照Trizol試劑盒（購自上海名勁生物科技有限公司）說明書提取總RNA，并采用Super-Script?Ⅲ試劑盒（購自北京智杰方遠科技有限公司）將RNA反轉錄合成cDNA。采用qRT-PCR MasterMix試劑盒（購自北京百奧萊博科技有限公司）及SYBR GreenⅠ染料（購自廈門致善生物科技有限公司）進行qRT-PCR，檢測血清let-7a水平。反應條件：95℃預變性30 s，95℃變性5 s，50℃復性15 s，75℃延伸30 s，共40個循環。以U6為內參基因，let-7a引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。反應結束后收集并整理實驗數據，分析 Ct值，采用 2-ΔΔCt法計算 let-7a相對表達量。

1.3 統計學方法

采用SPSS 21.0軟件對數據進行統計分析，符合正態分布的計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗；計數資料以例數和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；采用Logistic回歸模型進行多因素分析；采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線分析let-7a水平對喉癌手術患者預后的預測價值。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 喉癌手術患者預后影響因素的單因素分析

隨訪3年內，共21例（24.71%）患者死亡。死亡組和生存組患者的性別、年齡比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。死亡組和生存組患者的腫瘤類型、分化程度、T分期、TNM分期及let-7a水平比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。（表1）

表1 喉癌手術患者預后影響因素的單因素分析

2.2 喉癌手術患者預后影響因素的多因素Logistic回歸分析

以單因素分析中差異有統計學意義的因素作為自變量，以喉癌手術患者預后作為因變量進行Logistic回歸分析，結果顯示，腫瘤類型、分化程度、T分期、TNM分期及let-7a水平均是喉癌手術患者預后的獨立影響因素（P＜0.05）。（表2）

表2 喉癌手術患者預后影響因素的多因素Logistic回歸分析（ n=85）

2.3 let- 7 a對喉癌手術患者預后的預測價值

ROC曲線分析結果顯示，血清let-7a水平預測喉癌手術患者預后的曲線下面積為0.923，截斷值為0.66，靈敏度為85.70%，特異度為84.40%。（圖1）

圖1 let- 7 a預測喉癌手術患者預后的ROC曲線

3 討論

喉癌是咽喉部常見的惡性腫瘤，其早期可表現為聲音嘶啞、喉部異物感、咯血等[11]。在中國，喉癌約占全身腫瘤的5%，約占頭頸部腫瘤的20%[12]。全球統計資料表明，近年來喉癌的發病率呈大幅度上升趨勢[13]。本研究對納入的85例喉癌患者隨訪3年，其中21例患者死亡，死亡率為24.71%，提示喉癌患者術后的死亡風險較大。研究發現，淋巴結轉移是喉癌患者術后生存的高危因素[14-15]。因此，尋找合適的標志物預測喉癌手術患者預后具有重要意義。

miRNA是一類長約22個核苷酸的非編碼RNA，廣泛存在于從病毒到人類的各種真核生物中。研究顯示，人類大部分惡性腫瘤如胃癌、胰腺癌、結腸癌等均具有miRNA異常表型，miRNA在細胞的生長、分化、凋亡及腫瘤的發生、轉移、耐藥等過程中發揮著重要作用[16-18]。據報道，外周血miRNA水平具有腫瘤相關性及組織特異性，使miRNA作為惡性腫瘤早期診斷與預后判斷的血清標志物成為可能[19]。let-7a是第二個被鑒定出的miRNA，是miRNA家族中研究最多且較為重要的成員之一。let-7a轉錄的抑癌miRNA與原癌基因Ras、c-myc的mRNA遵循堿基互補配對原則，從而抑制Ras、c-myc的表達，也可靶向抑制高遷移率族蛋白A2的表達，從而抑制腫瘤的侵襲和轉移[20]。報道顯示，在喉癌、肝癌、宮頸癌等諸多惡性腫瘤中均存在let-7a表達明顯下調的現象。馬麗娟等[9]研究指出，喉癌組織中let-7a水平明顯下調，且與腫瘤分期和淋巴結轉移有關。周恩等[21]研究指出，let-7a能夠抑制喉癌細胞增殖，并加速其凋亡，喉癌患者的血清let-7a水平較低，且let-7a水平與喉癌患者的淋巴結轉移情況有關，let-7a有助于術后病情監測。許文景等[22]研究顯示，肝細胞癌患者血清和肝癌組織中let-7a呈異常低水平表達，且肝癌組織中let-7a水平遠低于癌旁組織。武燕和王福花[23]的研究指出，宮頸癌患者的血清let-7a呈低表達。本研究中，死亡組患者的let-7a水平明顯低于生存組（P＜0.01），與上述研究報道的結果一致。也有研究發現，let-7a與乳腺癌[24]、肝細胞癌[25]、卵巢癌[26]等患者的預后有關。但血清let-7a水平能否用于預測喉癌手術患者的預后尚未見報道。本研究進一步進行Logistic回歸分析，結果顯示，腫瘤類型、分化程度、T分期、TNM分期及let-7a水平均是喉癌手術患者預后的獨立影響因素（P＜0.05）。ROC曲線分析結果顯示，血清let-7a水平預測喉癌手術患者預后的曲線下面積為0.923，截斷值為0.66，靈敏度為85.70%，特異度為84.40%，表明let-7a對喉癌手術患者預后具有重要的預測價值。綜上所述，let-7a是喉癌手術患者預后的獨立預測因子，對預測喉癌手術患者預后具有重要意義。但本研究也存在不足，首先，本研究屬于單中心回顧性研究，僅對患者入院時的血清let-7a水平進行了檢測，未動態監測其水平變化；其次，本研究樣本量較小，仍需大規模多中心研究加以驗證。