非小細胞肺癌患者外周血自然殺傷細胞受體表達及與腫瘤標志物的關系研究

張靖悅，鄭光輝，楊常建，閆建強

平煤神馬醫療集團總醫院腫瘤內科，河南 平頂山 467000

非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）是最常見的肺癌類型，約占肺癌總數的80%，由于NSCLC的早期癥狀不明顯，許多患者在就診時已發展到中晚期，導致預后極差，病死率高[1]，故早期診斷和積極治療是NSCLC防治的關鍵。正常生理狀態下免疫系統能夠清除突變細胞，而NSCLC的發生發展與腫瘤細胞逃避機體免疫監視密切相關[2]。自然殺傷（natural killer，NK）細胞是機體重要的免疫細胞，可直接殺傷腫瘤細胞，其細胞表面包括可激發NK細胞產生殺傷作用的活化性受體[自然殺傷細胞2族成員D（natural killer group 2 member D，NKG2D）、自然殺傷細胞活化性受體p30（natural killer p30，NKp30）、自然殺傷細胞活化性受體 p44（natural killer p44，NKp44）等]和抑制NK細胞殺傷作用的抑制性受體[自然殺傷細胞2族 成 員 A（natural killer group 2 member A，NKG2A）、CD158a、CD158b][3-4]。腫瘤細胞可通過抑制活化性受體的表達及促進抑制性受體的表達，而削弱NK細胞對腫瘤細胞的免疫監視及清除作用[5-6]。腫瘤標志物是腫瘤輔助診斷的新突破，對NSCLC的早期診斷有一定價值[7-8]。因此，本研究擬分析NSCLC患者外周血NK細胞受體的表達及與腫瘤標志物的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年1月至2020年12月平煤神馬醫療集團總醫院收治的NSCLC患者的病歷資料。納入標準：均經病理檢查診斷為NSCLC；首次發病；未接受過放化療等抗腫瘤治療。排除標準：合并急性感染性疾病；既往有腫瘤病史。根據納入、排除標準，共納入122例NSCLC患者作為NSCLC組，其中，男性73例，女性49例；年齡36～85歲，平均（59.68±11.24）歲；病理類型：腺癌62例，鱗狀細胞癌41例，大細胞癌19例；TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期47例，Ⅲ～Ⅳ期75例。另選取同期在平煤神馬醫療集團總醫院體檢的46例健康體檢者作為對照組，其中男性29例，女性17例；年齡32～81歲，平均（61.34±9.46）歲。兩組研究對象性別、年齡比較，差異均無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。本研究經醫院倫理委員會審批通過，所有患者均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 檢測方法

1.2.1 樣本采集采集兩組研究對象空腹外周靜脈血各兩管，每管采集5 ml，其中一管用于外周血NK細胞受體表達檢測，需于采集后2 h內檢測，另一管用于血清腫瘤標志物水平檢測，待離心分離血清后，可于-80℃冰箱保存待測。

1.2.2 外周血NK細胞受體表達檢測每個流式管中加入50 μl全血，再加入5 μl anti-CD3-FITC、anti-CD56-APC、anti-CD16-Per CP，然后每管再分別加入5 μl單克隆抗體（anti-NKG2D-PE、anti-NKp30-PE、anti-NKp44-PE、anti-NKG2A-PE、anti-CD158a-PE、anti-CD158b-PE），同時設置陰性對照組，加入相同熒光標記的同種免疫球蛋白。各組樣本經充分混勻后，在室溫下放置20 min，再加入細胞裂解液室溫靜置10 min，再加入磷酸鹽緩沖液振蕩混勻，再用磷酸鹽緩沖液洗滌2次，然后使用流式細胞儀進行上機檢測。

1.2.3 血清腫瘤標志物水平檢測采用酶聯免疫吸附法檢測兩組研究對象血清腫瘤標志物[癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、細胞角質蛋白19片段抗原21-1（cyto-keratin 19 fragment antigen 21-1，CYFRA21-1）、神經元特異性烯醇化酶（neuron specific enolase，NSE）]水平，試劑盒均購自瑞士羅氏公司，實驗操作步驟按照試劑盒說明書進行操作。

1.3 統計學分析

采用SPSS 20.0軟件處理數據，符合正態分布的計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組比較采用單因素方差分析，兩組比較采用t檢驗，計數資料以例數表示，相關性分析采用Pearson相關分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 外周血NK細胞受體表達水平的比較

NSCLC組患者NK細胞活化性受體NKG2D、NKp30、NKp44表達水平均明顯低于對照組，抑制性受體NKG2A、CD158a、CD158b表達水平均明顯高于對照組，差異均有統計學意義（P＜0.01）。（表1）

表1 兩組研究對象外周血NK細胞受體表達水平的比較（%，x-± s）

2.2 不同病理類型及TNM分期NSCLC患者外周血NK細胞受體表達水平的比較

不同病理類型的NSCLC患者外周血NK細胞受體表達水平比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）；Ⅲ～Ⅳ期NSCLC患者NK細胞活化性受體NKG2D、NKp30、NKp44表達水平均明顯低于Ⅰ～Ⅱ期患者，抑制性受體NKG2A、CD158a、CD158b表達水平均明顯高于Ⅰ～Ⅱ期患者，差異均有統計學意義（t=11.205、4.725、3.002、7.162、5.287、8.112，P＜0.01）。（表2）

表2 不同病理類型及TNM分期NSCLC患者外周血NK細胞受體表達水平（%，x-± s）

2.3 血清腫瘤標志物水平的比較

NSCLC組患者血清腫瘤標志物CEA、CYFRA21-1、NSE水平均明顯高于對照組，差異均有統計學意義（P＜0.01）。（表3）

表3 兩組研究對象血清腫瘤標志物水平的比較（ng/ml，±s）

表3 兩組研究對象血清腫瘤標志物水平的比較（ng/ml，±s）

組別NSCLC組（n=122）對照組（n=46）t值CEA 37.36±3.83 1.47±0.52 63.220 CYFRA21-1 10.95±2.62 1.92±0.50 23.176 NSE 17.06±1.99 7.65±2.42 25.712 P值0.0000.0000.000

2.4 NSCLC患者外周血NK細胞受體表達與腫瘤標志物的相關性

Pearson相關性分析顯示，NSCLC患者活化性受 體 NKG2D、NKp30、NKp44及抑制性受體CD158a、CD158b表達與腫瘤標志物CEA、CYFRA21-1、NSE水平均無相關性（P＞0.05）；NSCLC患者抑制性受體NKG2A表達與CEA水平呈正相關（P＜0.05），與CYFRA21-1、NSE均無相關性（P＞0.05）。（表4）

表4 NSCLC患者外周血NK細胞受體表達與腫瘤標志物的相關性

3 討論

NSCLC是肺癌中最常見的組織類型，國內外的發病率和病死率均位居前列[9]。近年來，盡管肺癌的臨床診治方法得到了不斷提高與更新，也開始出現新的化療藥物及免疫治療藥物，但患者的整體預后仍不理想，這主要是由于多數患者在確診時已處于晚期階段[10-11]。目前，有關NSCLC的早期診斷和治療仍是中國乃至世界范圍需要迫切解決的一個重要難題。

細胞免疫系統是體內對抗腫瘤細胞的重要武器，主要的免疫細胞包括T細胞、B細胞、NK細胞，而NK細胞又是抵抗腫瘤細胞的第一道防線[12-13]。NK細胞表面受體按功能不同分為活化性受體和抑制性受體，NK細胞的活化受活化性受體和抑制性受體表達的調控[14]，正常情況下，活化性受體的上調可激活NK細胞，從而發揮直接殺傷腫瘤的作用，而且活化的NK細胞還可以通過誘導多種細胞因子和趨化因子的釋放而發揮免疫調節及殺傷靶細胞的作用[15-16]。本研究結果顯示，NSCLC組患者NK細胞活化性受體NKG2D、NKp30、NKp44表達均明顯低于對照組（P＜0.01），抑制性受體NKG2A、CD158a、CD158b表達均明顯高于對照組（P＜0.01），且不同TNM分期的NSCLC組患者外周血NK細胞受體表達存在明顯差異（P＜0.01），提示NK細胞活化性受體表達的降低和抑制性受體表達的升高可能與NSCLC的發生及疾病進展密切相關。

腫瘤標志物是一種化學類物質，對臨床疾病診斷和評估患者的預后有著重要意義[17]，近年來其也獲得了越來越多的關注，其中CEA、CYFRA21-1、NSE是用于輔助診斷NSCLC的常用腫瘤標志物[18-19]。本研究結果顯示，NSCLC組患者血清腫瘤標志物CEA、CYFRA21-1、NSE水平均明顯高于對照組（P＜0.01），這與以往的研究報道一致[20-21]。

然而，目前尚不清楚NSCLC患者外周血NK細胞表面受體與腫瘤標志物的關系。本研究通過Pearson相關性分析研究了NSCLC患者外周血NK細胞受體表達與腫瘤標志物的關系，結果發現NSCLC患者活化性受體NKG2D、NKp30、NKp44及抑制性受體CD158a、CD158b表達與腫瘤標志物CEA、CYFRA21-1、NSE水平均無相關性（P＞0.05）；NSCLC患者抑制性受體NKG2A表達與CEA 水平呈正相關（P＜0.05），與 CYFRA21-1、NSE均無相關性（P＞0.05）。提示NK細胞表面受體與腫瘤標志物有一定關系，但由于納入的樣本量有限需要在今后進行更大規模的驗證，以明確二者的關系。

綜上所述，NSCLC患者外周血NK細胞活化性受體表達降低，抑制性受體表達升高，其中活化性受體表達與腫瘤標志物無相關性，抑制性受體NKG2A表達與腫瘤標志物CEA呈正相關。