發(fā)酵巴戟天中多糖和寡糖降血糖作用研究

黃少杰,羅志鋒,陶倩,黎攀,杜冰*

1(華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院,廣東 廣州,510642) 2(無限極(中國)有限公司,廣東 廣州,510623)

巴戟天是茜草科巴戟屬植物巴戟天的干燥根,廣泛分布于熱帶、亞熱帶和溫帶地區(qū),在我國主要種植于廣東、廣西、福建、海南等地,是我國著名的草本植物之一[1]。巴戟天中含有豐富的糖類、蒽醌類、環(huán)烯醚萜類、氨基酸類等生物活性成分[2],其具有抗抑郁、抗腫瘤、抗衰老、增強(qiáng)生殖能力等多種藥理作用[3-5]。

中藥炮制可起到增強(qiáng)藥效、削弱毒性、改變功效活性等作用,其中發(fā)酵炮制是最古老且有效的方式之一,該方法主要通過微生物的生長代謝來充分利用和改變中藥材原始的藥效活性,從而達(dá)到促進(jìn)活性成分的提取分離、增強(qiáng)藥效等目的[6],目前關(guān)于微生物發(fā)酵炮制巴戟天的研究仍非常有限。有研究發(fā)現(xiàn),微生物發(fā)酵炮制能顯著提高巴戟天中的活性成分含量,如經(jīng)乳酸芽胞桿菌DU-106發(fā)酵后,巴戟天中多糖含量提高了30.09%,果糖等寡糖含量也有所提高[7]。

人體中的α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶是碳水化合物水解的主要酶,酶解中分解的葡萄糖會進(jìn)入血糖中,從而使人體的血糖水平升高[8];胰島素抵抗(insulin resistance,IR)是2型糖尿病、高血壓病、動脈粥樣硬化等一系列代謝相關(guān)疾病發(fā)生、發(fā)展的原動力,是其共同的病理生理基礎(chǔ)[9]。目前,我國已成為世界上糖尿病患者最多的國家,糖尿病是亟待解決的重大公共衛(wèi)生問題。

因中藥降血糖的作用溫和且持久,因此研究中草藥有效成分的降血糖活性及其機(jī)制對治療糖尿病具有重大意義。而目前有關(guān)巴戟天降血糖功效及其作用機(jī)制的研究較少,僅有關(guān)于巴戟天不同極性萃取相的抗氧化及降血糖活性[10],以及巴戟天多糖的降血糖和抗氧化作用的研究[11],故本研究利用發(fā)酵能提高巴戟天中多糖和寡糖含量的特點(diǎn),以發(fā)酵巴戟天為原料,探究了巴戟天中多糖、寡糖的降血糖功效及其藥效機(jī)理,旨在能更有效地利用巴戟天資源,同時(shí)為巴戟天在降血糖方面的藥理作用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

發(fā)酵巴戟天,由本研究室(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院新資源食品與功能性原料研究及評價(jià)中心)利用Bacillussp.DU-106發(fā)酵得到[12];HepG2細(xì)胞,中國科學(xué)院細(xì)胞庫;二甲基亞砜(dimethylsulfoxide,DMSO)、四甲基偶氮唑鹽(methylthiazoletetrazolium,MTT),Amresco公司;DMEM高糖培養(yǎng)基,Gibco公司;4-硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(4-Nitrophenyl-α-D-glucopyranoside,PNPG)、α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶,美國Sigma公司;鹽酸二甲雙胍片,貴州天安藥業(yè)股份有限公司;葡萄糖測定試劑盒,上海榮盛生物藥業(yè)有限公司;阿卡波糖,齊云生物試劑有限公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV759紫外分光光度計(jì),上海精密科學(xué)儀器有限公司;HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋,常州市華普達(dá)數(shù)學(xué)儀器有限公司;SH CO2細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱、BPH-9042恒溫培養(yǎng)箱,上海一恒科學(xué)儀器有限公司;Countess 2細(xì)胞計(jì)數(shù)儀、VarioskanTMLUX多功能酶標(biāo)儀,賽默飛世爾科技(中國)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 發(fā)酵巴戟天中多糖、寡糖的提取方法

將樣品烘干、粉碎過2號篩,在料液比為1∶42(g∶mL)、提取溫度為61 ℃、提取時(shí)間為1.6 h的條件下,加入體積分?jǐn)?shù)為45%的乙醇溶液進(jìn)行水提醇沉,取上清液以4 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心15 min,在提取液中加入一定量的無水乙醇,體積分?jǐn)?shù)為80%,4 ℃下靜置24 h,離心分離。

對沉淀物進(jìn)行水溶解,并隨后加入一定量乙醇,將體積分?jǐn)?shù)保持在60%,靜置處理2 d之后進(jìn)行分離獲得上清液,加入乙醇,體積分?jǐn)?shù)為80%,靜置48 h后離心分離,將沉淀物加入定量水溶解后冷凍干燥,即獲得巴戟天粗寡糖;分離得到的沉淀部分加入定量水溶解,高速離心后向沉淀中再加入一定體積水和乙醇,使乙醇的終體積分?jǐn)?shù)為60%,再進(jìn)行離心和醇沉,重復(fù)操作3次,合并上清液在4 ℃下透析36 h(截留分子質(zhì)量>1 000 Da),將透析得到的溶液冷凍干燥,得到巴戟天粗多糖。

1.3.2 發(fā)酵巴戟天活性組分的純化及其對α-葡萄糖苷酶活性的作用

將巴戟天粗寡糖凍干粉溶解后過D-900型離子交換大孔樹脂進(jìn)行純化[13];將巴戟天粗多糖凍干粉溶解后經(jīng)陰離子層析柱DEAE-Sepharose Fast Flow純化[7];根據(jù)1.3.5.1的方法測定巴戟天組分純化前后對α-葡萄糖苷酶活性抑制的作用。

1.3.3 多糖含量測定

參考文獻(xiàn)[7]采用苯酚-硫酸法對巴戟天多糖含量進(jìn)行測定，多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=7.072 7x-0.014 1,R2=0.999 1(n=9)。

1.3.4 寡糖含量測定

參考文獻(xiàn)[7]采用HPLC-ELSD法對巴戟天寡糖含量進(jìn)行測定，通過研究對比發(fā)現(xiàn)，需對D-果糖、D(+)-無水葡萄糖、蔗糖、1-蔗果三糖、耐斯糖、1F-果呋喃糖基、耐斯糖等進(jìn)行測定。

1.3.5 發(fā)酵巴戟天有效組分對體外酶活性抑制實(shí)驗(yàn)

1.3.5.1 α-葡萄糖苷酶活性抑制實(shí)驗(yàn)

參考許有瑞等[14]的方法,并稍作改進(jìn)。反應(yīng)體系如表1,其中加入阿卡波糖溶液和待測樣品溶液的質(zhì)量濃度梯度都為0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 g/L,樣液充分混勻后置于37 ℃恒溫箱中反應(yīng)15 min,再加入20 μL PNPG底物于各個(gè)組別中,充分混勻后用塑料膜密封微孔板并置于37 ℃恒溫箱中反應(yīng)30 min,最后加入80 μL Na2CO3溶液終止液以終止反應(yīng),置于波長405 nm下進(jìn)行測定,計(jì)算出抑制率及半抑制率(IC50)。本研究設(shè)置3組平行,每組進(jìn)行3次重復(fù),抑制率計(jì)算如公式(1)所示,其中A1、A2、A3、A4分別為實(shí)驗(yàn)組、樣品對照組、空白對照組和空白組吸光值。

(1)

表1 α-葡萄糖苷酶活性抑制體系 單位：μL

1.3.5.2 α-淀粉酶活性抑制試驗(yàn)

參考MCCUE等[15]的方法,并稍作修改。反應(yīng)體系如表2,其中加入阿卡波糖溶液和待測樣品溶液的質(zhì)量濃度梯度都為0.24、0.5、1、2、4、8 g/L,充分混勻后置于37 ℃恒溫箱中孵化10 min,將溶解于pH 6.8 PBS的1%淀粉溶液預(yù)熱至37 ℃并轉(zhuǎn)移0.5 mL于試管中,充分混勻后置于37 ℃恒溫箱中反應(yīng)10 min,加入1 mL DNS并置于沸水浴中5 min,冰浴冷卻后用去離子水稀釋,置于波長520 nm下進(jìn)行吸光值測定,計(jì)算出抑制率及半抑制率(IC50)。本研究設(shè)置3組平行,每組進(jìn)行3次重復(fù),抑制率按公式(1)計(jì)算。

表2 α-淀粉酶活性抑制體系 單位：mL

1.3.5.3 兩種有效組分對體外酶抑制活性協(xié)同作用實(shí)驗(yàn)

參考余娜[16]的方法。基于實(shí)驗(yàn)測定得到2種有效組分樣品和阿卡波糖的IC50(g/L),以各組分的IC50為基礎(chǔ)配制5個(gè)質(zhì)量濃度的樣品和阿卡波糖溶液,分別為0.25 IC50、0.5 IC50、IC50、2 IC50、4 IC50。研究2種組分間對α-葡萄糖苷酶抑制的交互作用時(shí),將各個(gè)濃度按體積比1∶1混合,根據(jù)上述1.3.5.1和1.3.5.2方法分別測定混合后對α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制活性。相互作用指數(shù)CI值(combination index)由CompuSyn軟件分析計(jì)算,作為評價(jià)成分間是否存在協(xié)同或拮抗作用的指標(biāo)。

1.3.6 發(fā)酵巴戟天有效組分對IR-HepG2細(xì)胞葡萄糖攝取量的影響

1.3.6.1 胰島素抵抗HepG2細(xì)胞模型的建立

參考包橋橋等[17]的方法,取處于對數(shù)生長期且狀態(tài)良好的細(xì)胞,在含質(zhì)量濃度為0.01 g/L胰島素的DMEM培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h,隨后以無血清無酚紅DMEM專用高糖培養(yǎng)基進(jìn)行同步化操作,時(shí)長為12 h,在細(xì)胞壁覆蓋超過80%之后開始測定,獲得上清液中的葡萄糖比例,從而以細(xì)胞對應(yīng)的葡萄糖消耗程度(glucose consuming,GC)表示。通過比較模型組和正常HepG2細(xì)胞組的GC值判斷是否成功得到胰島素抵抗HepG2細(xì)胞模型(IR-HepG2細(xì)胞)。造模成功后,運(yùn)用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個(gè)/mL。

1.3.6.2 有效組分對IR-HepG2細(xì)胞增殖能力的影響

參考程玥等[18]的方法,在實(shí)驗(yàn)組中加入100 μL不同質(zhì)量濃度(0.5、1、2、4、8、16 g/L)的多糖和寡糖組分,每個(gè)濃度設(shè)置4個(gè)復(fù)孔;對照組運(yùn)用含有DMSO溶液的培養(yǎng)基;在空白對照組中不加入細(xì)胞、藥物試樣;在正常組中運(yùn)用含有DMEM的培養(yǎng)基。處理后置于37 ℃、5.0% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,隨后在CCK-8溶液中反應(yīng)2 h,采用酶聯(lián)免疫檢測儀在波長450 nm對孔吸光值進(jìn)行測定,細(xì)胞存活率按公式(2)計(jì)算,其中A1、A2、A3和A4分別為實(shí)驗(yàn)組、對照組、空白對照組和正常組吸光值。

(2)

1.3.6.3 三種有效組分單獨(dú)及復(fù)配后對IR-HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗的影響

參考WANG等[19]的實(shí)驗(yàn)方法,并稍作修改。空白對照組僅加入200 μL無血清無酚紅的DMEM高糖培養(yǎng)基,在正常組每個(gè)孔內(nèi)加入200 μL正常 HepG2細(xì)胞培養(yǎng)液,模型組、實(shí)驗(yàn)組和陽性對照組中每個(gè)孔加入200 μL IR-HepG2細(xì)胞培養(yǎng)液,將一系列濃度的樣品以及復(fù)配組分樣品(根據(jù)1.3.5部分篩選)加入實(shí)驗(yàn)組,陽性對照組加入二甲雙胍使終質(zhì)量濃度為1.0 g/L,每組重復(fù)6孔。添加完試劑后置于37 ℃、5.0% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,采用葡萄糖試劑盒測定葡萄糖比例,從而獲得GC值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)結(jié)果采用Excel 2016、Origin 9.1和CompuSyn等統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵巴戟天中有效組分的純化及降血糖組分的確定

由表3可知,巴戟天粗多糖經(jīng)過一系列除雜處理以及陰離子層析柱DEAE-Sepharose Fast Flow純化后,其總多糖含量達(dá)到98.3%,其對α-葡萄糖苷酶活性抑制率也顯著提高到23.62%;同樣,巴戟天粗寡糖組分經(jīng)D-900型離子交換大孔樹脂純化后,其純度為93.2%,對α-葡萄糖苷酶活性抑制率也顯著增強(qiáng)到6.63%。

表3 有效組分的純化及其純化后對α-葡萄糖苷酶活性的抑制率 單位：%

通過對巴戟天中多糖和寡糖進(jìn)行純化且進(jìn)行α-葡萄糖苷酶活性試驗(yàn),可初步篩選出巴戟天發(fā)揮降血糖功效的活性成分。巴戟天中的多糖和寡糖對酶的抑制率隨著純度的升高而增大,說明巴戟天中的多糖和寡糖組分對抑制α-葡萄糖苷酶的活性起著主要的調(diào)節(jié)作用。故本研究中分離純化出的2種有效成分可以作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)。

2.2 有效組分體外對α-葡萄糖苷酶活性抑制研究

2.2.1 有效組分對α-葡萄糖苷酶抑制作用研究

由圖1可知,2種有效降糖組分對α-葡萄糖苷酶的抑制作用會隨濃度提升而不斷加強(qiáng),且可以獲得較好的線性關(guān)系。在同等濃度下,不同組分對α-葡萄糖苷酶的抑制活性由強(qiáng)到弱排序?yàn)椋喊⒖úㄌ?多糖>寡糖。發(fā)酵巴戟天多糖的降血糖作用在低濃度時(shí)較弱,但在質(zhì)量濃度1.6～2.4 g/L其活性顯著增強(qiáng),有接近阿卡波糖活性的趨勢;寡糖對α-葡萄糖苷酶活性抑制效果較弱,對酶的抑制作用隨濃度上升而緩慢增強(qiáng)。結(jié)果表明,這2種有效成分都能抑制α-葡萄糖苷酶的活性,此結(jié)果與許定舟等[20]和WANG等[21]的研究結(jié)果一致。

圖1 發(fā)酵巴戟天不同活性組分對α-葡萄糖苷酶活性抑制作用Fig.1 Inhibition of α-glucosidase activity by different active components of fermented M.officinalis

2.2.2 有效組分對α-葡萄糖苷酶抑制活性協(xié)同作用研究

通過將不同組分配制成不同的濃度進(jìn)行酶抑制活性實(shí)驗(yàn),得出巴戟天多糖的IC50為2.151 g/L,寡糖的IC50較大(12.438 g/L),說明在相同濃度下,巴戟天多糖的降血糖效果更接近陽性對照組的阿卡波糖(IC50=1.05 g/L);由表4可知,這2種組分及其復(fù)配后在5個(gè)質(zhì)量濃度下對α-葡萄糖苷酶的抑制作用隨著濃度的增大而增強(qiáng),均呈現(xiàn)出劑量依賴效應(yīng),另外,表中的各組分復(fù)配前后的r值均大于0.95,說明不同組分的劑量和效應(yīng)之間的線性關(guān)系非常良好,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)具有關(guān)聯(lián)性和可靠性。

表4 兩種有效組分復(fù)配前后對α-葡萄糖苷酶的抑制作用Table 4 Inhibition of α-glucosidase before and after the combination of two active components

續(xù)表4

由圖2可知,在5個(gè)不同質(zhì)量濃度下有效組分進(jìn)行復(fù)配后對α-葡萄糖苷酶的協(xié)同抑制作用也有差異,多糖與寡糖復(fù)配組在抑制率≤25%時(shí),CI>1,說明多糖和寡糖的復(fù)配在抑制率達(dá)到25%的范圍內(nèi)是相互拮抗的關(guān)系,當(dāng)質(zhì)量濃度升高時(shí),CI<1且逐漸減小,表明復(fù)配后其協(xié)同作用會隨著濃度的增大而顯現(xiàn)出來,并且濃度越大,協(xié)同作用越顯著。

圖2 兩種有效組分聯(lián)合作用后的劑量-效應(yīng)曲線Fig.2 The dose-response curve of the two active components after combination

2.3 有效組分體外對α-淀粉酶活性抑制研究

2.3.1 有效組分對α-淀粉酶抑制作用研究

由圖3可知,巴戟天中的2種活性成分都對α-淀粉酶有一定抑制作用,并且均隨著濃度的增大而明顯增強(qiáng),此結(jié)果與相關(guān)研究結(jié)果一致[22-23]。有效組分中寡糖對α-淀粉酶的抑制最弱,當(dāng)質(zhì)量濃度為8 g/L時(shí),巴戟天多糖和寡糖對α-淀粉酶的抑制率分別為(72.39±0.38)%和(65.2±0.55)%,兩者的抑制率均低于陽性對照組中阿卡波糖的抑制率。α-淀粉酶是人體內(nèi)將淀粉水解并轉(zhuǎn)化為葡萄糖和低聚糖的關(guān)鍵酶之一,因此研究巴戟天有效組分對α-淀粉酶的抑制作用對糖尿病的治療和預(yù)防有科學(xué)價(jià)值。

圖3 發(fā)酵巴戟天不同活性組分對α-淀粉酶活性抑制作用Fig.3 Inhibition of α-amylase activity by different active components of fermented M.officinalis

2.3.2 有效組分對α-淀粉酶抑制活性協(xié)同作用研究

有效降糖組分多糖和寡糖對α-淀粉酶的IC50分別為3.104、5.008,說明多糖的抑制效果強(qiáng)于寡糖,均高于陽性對照組阿卡波糖(IC50=0.441 g/L)。由表5可知,2種成分復(fù)配后的r值>0.95,表明劑量與效應(yīng)之間的線性關(guān)系良好。因此,研究組分間協(xié)同效應(yīng)的劑量-效應(yīng)曲線可根據(jù)表5中的數(shù)據(jù)制作得到。

表5 兩種有效組分復(fù)配前后對α-淀粉酶的抑制作用Table 5 Inhibition of α-amylase before and after the combination of the two active components

由圖4可知,雖然組分復(fù)配后的CI值呈現(xiàn)隨著抑制率升高而降低的趨勢,但始終大于1,表明多糖和寡糖之間對于抑制α-淀粉酶活性只具有簡單相加作用,甚至拮抗作用。

圖4 兩種有效組分聯(lián)合作用后的劑量-效應(yīng)曲線Fig.4 The dose-response curve of the two active components after combined action

2.4 有效組分對IR-HepG細(xì)胞活性和葡萄糖攝取量的影響

2.4.1 有效組分單獨(dú)及復(fù)配對IR-HepG2細(xì)胞活性的影響

如圖5、圖6所示,以樣品溶劑DMSO作為對照,與正常組相比沒有顯著的差異,說明樣品溶劑對細(xì)胞的生長沒有抑制作用。

圖5 不同質(zhì)量濃度的有效組分單獨(dú)對IR-HepG2細(xì)胞活性的影響Fig.5 Effects of different concentrations of active components on the activity of IR-HepG2 cells

與對照組的細(xì)胞存活率相比,巴戟天多糖和寡糖單獨(dú)或復(fù)配作用時(shí),細(xì)胞的存活率會出現(xiàn)輕微地下降,但細(xì)胞的存活率都在90%以上,說明有效組分并不影響IR-HepG2細(xì)胞的正常生長,故后續(xù)試驗(yàn)所選用的有效組分單獨(dú)作用和復(fù)配作用質(zhì)量濃度分別在0.5～16 g/L和0.5 IC50、IC50和2 IC50范圍內(nèi)。

圖6 不同濃度的有效組分復(fù)配對IR-HepG2細(xì)胞活性的影響Fig.6 Effects of different concentrations of active components on the activity of IR-HepG2 cells

2.4.2 有效組分單獨(dú)及復(fù)配對IR-HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗量的影響

從表6可知,和正常組相比,模型組葡萄糖消耗量明顯較少,差額為40.90%,這意味著造模發(fā)揮作用,結(jié)果具有顯著性差異。

表6 有效組分單獨(dú)及復(fù)配對IR-HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗量的影響Table 6 Effects of active components on glucose consumption in IR-HepG2 cells alone or in combination

陽性對照組中IR-HepG2細(xì)胞在二甲雙胍的作用下葡萄糖消耗量較模型組顯著增大,但與正常組的葡萄糖消耗量仍有顯著的差異,并存在11.29%的葡萄糖差值。與正常組相比,0.5 IC50的較低濃度下3組實(shí)驗(yàn)組均與模型組的葡萄糖消耗量沒有顯著性差異,但隨著質(zhì)量濃度的升高,在單組分樣品的作用下IR-HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗量明顯增大,此結(jié)果與劉亞萍等[24]實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似。多糖+寡糖組與2種單一有效組分比較,IR-HepG2細(xì)胞的葡萄糖消耗量也有所增加。因此,中高劑量的單組分和復(fù)配組分樣品組都能夠促進(jìn)IR-HepG2細(xì)胞中葡萄糖的消耗,具有較好的降糖活性。

3 結(jié)論

發(fā)酵巴戟天中多糖和寡糖單獨(dú)或聯(lián)合使用均對α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的活性具有明顯的抑制作用,且抑制效果與組分的質(zhì)量濃度呈正相關(guān);同時(shí),這2種有效組分均能在一定程度上改善IR-HepG2細(xì)胞胰島素抵抗作用,促進(jìn)IR-HepG2細(xì)胞的葡萄糖攝取。本研究結(jié)果為巴戟天降血糖活性成分的作用機(jī)制提供了理論依據(jù),對治療糖尿病具有重要意義。