清香型小曲白酒霉菌菌群解析與酶活特性研究

朱麗萍,楊強,江威,李群,林斌,唐潔,陳申習

(勁牌有限公司 勁牌研究院 中藥保健食品質量與安全湖北省重點實驗室,湖北 大冶,435000)

清香型小曲白酒作為我國主要白酒種類之一,有著清香純正、醇甜柔和、余味爽凈的獨特風味[1-2],備受人們喜愛。其以富含淀粉質的糧食為原料,以富含多種微生物的綠衣觀音土曲為糖化發酵劑釀造而成。綠衣觀音土曲以觀音土、米粉、米糠為主要原料,接入曲種,通過加水拌料,制成坯,入箱進行微生物培育,開箱后轉入培養室進行一至七燒共7輪培養,然后烘干制成[3]。霉菌作為重要的小曲白酒釀造微生物,在白酒發酵過程中發揮著重要作用,主要表現在能產生多種活性酶[4-5],如糖化酶、纖維素酶、蛋白酶、酯化酶、果膠酶等,對降解釀造原料和推動呈香呈味物質的形成具有重要貢獻[6-8]。因此解析白酒發酵過程中霉菌種群結構,有助于對其中功能菌株的發酵特性進行研究[9-10]。

目前研究者對醬香型[11-12]、濃香型白酒[13-14]中的霉菌菌群研究較多。向玉萍等[11]從茅臺醬香型大曲中分離鑒定出55株10個屬的霉菌,并對不同種類大曲間霉菌種屬差異性進行了分析;劉冰冰等[13]從濃香型白酒的酒醅中分離出15株霉菌,并對其產酶特性進行了研究。而對清香型小曲白酒中的霉菌研究多數集中于易于分離的幾種,如根霉[15],對于難分離、難鑒定的霉菌鮮有報道,導致清香型小曲白酒中可以明確應用于釀造生產中的功能霉菌較少[16-17]。且同一種屬的不同菌株間的生理生化特性存在一定差異,王旭亮等[18]從清香、濃香、醬香大曲中分離得到8株糖化酶活力較高的根霉,其與酵母模擬白酒酒精發酵結束后,各菌株培養基中的酒精含量和出酒率均不同。

近幾年高通量測序技術被廣泛應用于釀造微生物的檢測中,該技術可以對樣品中微生物信息進行解析,適合于微生物區系、群落結構、分布情況及生長變化規律研究,但一般只可鑒定到屬,且無法獲得菌株。經典分離培養鑒定技術可鑒定到種,并分離得到活菌株,有利于對獲得的菌株進行進一步研究,適合于微生物生理生化特性和生產應用研究。

本研究使用經典分離培養鑒定法,通過優化培養基,從清香型小曲白酒酒曲和酒醅中分離出20株疑似霉菌,借助分子生物學技術進行了種屬鑒定,并優化了適合霉菌分離、生長的培養基。對部分難以確定種屬的霉菌,通過改變PCR擴增體系及擴增條件,成功進行了鑒定,并還原了不同發酵階段的主要霉菌種類。同時,對霉菌產水解酶組成及酶活力進行了解析。為進一步提升清香型小曲原酒釀造品質提供了霉菌資源。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗樣品及培養基

綠衣觀音土曲、糖化醅和發酵醅為2019年10～12月由勁牌有限公司提供。

PDA培養基(g/L)：馬鈴薯200,葡萄糖20,瓊脂20,pH自然。

察氏培養基(g/L)：NaNO33,K2HPO41,MgSO4·7H2O 0.5,KCl 0.5,FeSO40.01,蔗糖30,瓊脂20,pH自然或7.0～7.2。

孟加拉紅培養基(g/L)：蛋白胨5,葡萄糖10,KH2PO41,MgSO4·7H2O 0.5,瓊脂20,孟加拉紅0.033。

改良PDA培養基[19](g/L)：PDA培養基/L,牛肉膏2,酵母粉2,KH2PO42.5,吐溫-20 1.5 mL。

YPD培養基(g/L)：酵母膏10,蛋白胨20,葡萄糖20,瓊脂20。

以上培養基在121 ℃滅菌20 min,冷卻至50～60 ℃,加入質量分數為0.01%青霉素,搖勻倒平板。

1.1.2 實驗材料

土壤基因組DNA提取試劑盒,天根生化科技(北京)有限公司。

1.1.3 主要儀器與設備

104C ECLIPSE E200顯微鏡,日本尼康有限公司;SF-CF-2A超凈工作臺,鄭州南北儀器設備有限公司;WD-9413B凝膠成像系統,北京六一電泳儀器廠;2720 PCR儀,賽默飛世爾科技公司;HH-S恒溫水浴鍋,上海索譜儀器有限公司;Neofuge 18R高速冷凍離心機,上海Heal Force公司;721型分光光度計,尤尼柯上海儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 取樣方法

酒曲：每份曲樣200 g左右,存放于4 ℃冰箱中。

糖化醅、酒醅：毛鋪三分廠釀造三車間,跟蹤同一批次1個糖化池、4個發酵槽車,共計取3批次。收集糖化0、6、12、18 h和終點的糖化醅,每種糖化醅收集1份,每份250 g;收集發酵0、1、2、3、4、5、7、9、11、14 d的酒醅,每天每個發酵槽車收集1份,每份250 g,樣品存放于4 ℃。糖化池取樣位置如圖1所示，4.2 m×2.0 m的中格為取樣格，每個取樣格內有5個點，先取中心點作為糖化0 h的樣品，余下4點為6、12、18 h和終點的樣品。每個取樣點收集中層的樣品(約0.3 m深)。4個取樣格即為4個平行。

圖1 糖化池取樣位置(俯視圖)Fig.1 Sampling location of the saccharification tank(top view)

發酵槽車取樣位置如圖2所示，實心點即為取樣的實際位置。每個取樣點收集中層的樣品(約0.5～0.6 m深)。4個發酵槽車即為4個平行。

圖2 發酵槽車取樣位置(側視圖)Fig.2 Sampling location of the fermentation tank car(side view)

1.2.2 真菌分離

準確稱取樣品5 g加入95 mL無菌水中,150 r/min振蕩20～30 min,配制成菌懸液。分別取1 mL混合液至盛有9 mL滅菌水的試管中,依次制作成10-1、10-2、10-3、10-4梯度菌液,取200 μL的不同稀釋液涂布于上述5種培養基中,放置于30 ℃培養,2～5 d后形態觀察。

1.2.3 菌落形態觀察

將在PDA上活化菌株,然后分別接種到孟加拉紅、YPD、PDA培養基上,將平板倒置在30 ℃溫箱中培養,觀察第5天的菌落形態特征,主要記錄其菌落形態、生長速度、氣生菌絲疏密和產色素情況等,記錄并拍照。

1.2.4 顯微形態觀察

取無菌蓋玻片,以傾斜約45°方式插入PDA培養基中,每皿插入3～4片,30 ℃溫箱中倒置培養5 d,取蓋玻片在顯微鏡下觀察包括菌絲顏色及形態、孢子形態在內的顯微形態特征,記錄并拍照[20]。

1.2.5 分子生物學鑒定

真菌模板的制備：使用土壤中微生物基因提取試劑盒提取法提取模板DNA。

PCR反應體系為30 μL：PremixTaq(EX Taq Version 2.0)15 μL,DNA模板2 μL,引物1 μL,采用真菌通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′),dd H2O 12 μL。

PCR擴增程序為：95 ℃ 5 min;95 ℃ 45 s,52 ℃ 45 s,72 ℃ 110 s,循環35次;72 ℃ 10 min,4 ℃保溫。

瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物,送往武漢華大基因科技股份有限公司完成測序。測序結果與美國國家生物信息技術中心(National Center of Biotechnology Information,NCBI)數據庫中已知序列進行BLAST比對。采用基因序列分析軟件DNAMAN和構建系統發育樹軟件MEGA 6,與GenBank數據庫中相關屬種基因序列進行系統發育分析。

1.2.6 酶活力測定方法

酸性蛋白酶測定參照國標GB 1886.174—2016《食品安全國家標準 食品添加劑 食品工業用酶制劑》的方法測定蛋白酶活力;糖化酶測定方法采用3,5-二硝基水楊酸(3,5-dinitrosalicylic acid,DNS)法[21];纖維素酶測定方法采用DNS法[22];果膠酶測定方法采用DNS法[23]。

2 結果與分析

2.1 霉菌的初篩結果分析

選用5種不同培養基對清香型小曲白酒酒曲和酒醅中的霉菌進行分離篩選,共計篩選得到46株菌落形態不同的疑似霉菌,5種培養基中觀察到疑似霉菌的種類,統計結果如表1所示。

表1 不同培養基中篩選得到的疑似霉菌菌種數Table 1 The number of suspected mold species screened from different media

對5種培養基中的疑似霉菌菌落觀察發現,PDA、YPD和孟加拉紅3種培養基中的菌落顏色較鮮艷,各菌落間形態差異較大,相同生長時間內菌落直徑較大。而改良PDA培養基中加入鹽類和吐溫-20,其菌株生長速度較PDA培養基中慢,且菌絲蔓延的情況得到了很好的抑制,但菌株形態種類明顯減少,菌絲變短且多聚成小絮狀。察氏培養基通過加入高含量的鹽,以抑制雜菌生長,但明顯也影響霉菌的生長,培養3 d仍無明顯菌落長出,至5 d有部分菌落長出,且菌落顏色較淺,菌絲短而稀疏。

故選擇PDA、YPD和孟加拉紅培養基,對46株疑似霉菌進行復篩。

2.2 霉菌復篩結果分析

根據同一種菌株在不同培養基中菌落形態不同的特點,將46株菌株分別點接到PDA、YPD和孟加拉紅培養基上,平板倒置在30 ℃下培養觀察5 d,根據3種培養基上的菌落形態、顏色和菌落大小等因素將46株進一步歸屬為20個種類,編號為M1～M20,結果如圖3所示。

圖3 二十種疑似霉菌菌株菌落形態Fig.3 Colonial morphology of 20 suspected mold strains注：從左至右依次為孟加拉紅、PDA、YPD

初篩時20種菌株,在PDA中生長的有9種,在YPD中生長的有9種,在孟加拉紅中生長的有3種,在改良PDA中生長的有2種,在察氏培養基中生長的有4種。僅在1種培養基中生長的菌株情況為：PDA上有3種,YPD上有4種,察氏培養基上有2種,結果如表2所示。

表2 不同培養基中篩選得到的疑似霉菌菌種數Table 2 Comparison of the number of suspected mold species obtained in different media

通過復篩可知PDA、YPD有利于霉菌的篩選,其中YPD中霉菌生長菌落較大,顏色鮮艷,復篩菌種數多,僅在該培養基上生長的菌種多,為較好的霉菌篩選培養基。察氏培養基雖然生長較慢,但復篩菌種數為4種,且有2種菌株僅在該培養基上生長,是很好的霉菌初篩培養基。故PDA、YPD和察氏培養基可作為霉菌良好的篩選培養基。

2.3 復篩菌株的顯微形態觀察結果分析

復篩得到的20株疑似霉菌,使用插片法觀察菌株的顯微形態,在PDA培養基中培養5 d后觀察到的顯微形態,結果如圖4所示。

圖4 二十株菌株的顯微形態圖Fig.4 Microscopic morphologies of 20 strains

根據顯微形態觀察發現菌種M1和M15疑似根霉,M2疑似毛霉,M3和M5疑似毛白地霉,M4疑似酵母菌,M7、M9、M10、M16、M19疑似青霉,M8、M11～M14、M17、M18疑似曲霉,M20疑似為枝孢霉,M6為待定菌株。為科學確定菌株種屬類別,對以上20株菌種進行分子生物學鑒定。

2.4 分子生物學鑒定結果分析

對復篩獲得的20株疑似霉菌,提取菌株DNA為模板,并進行PCR擴增,經瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物,除菌株M7和M16外,均有條帶。將PCR產物驗證成功的菌株,送往華大基因有限公司進行測序。結果顯示,絕大部分峰圖較理想,波峰與波谷清晰,峰與峰之間的距離均勻,底部基本未見雜峰。而M1、M4、M12號菌株底部套峰貫穿整個峰圖,降低了BLAST比對結果的可靠性。

霉菌M7和M16 PCR擴增產物檢測無條帶,可能內轉錄間隔區(internal transcribed spacer,ITS)引物在該PCR反應體系及反應程序下,無法與其DNA模板結合進行擴增,可改變擴增引物;M1、M4、M12號菌株測序結果出現套峰,說明測序反應產物不純,有不止一種測序反應產物存在,可提高退火溫度,提高反應的特異性。

為詳細鑒定微生物種屬,了解微生物種群結構,對未成功鑒定的菌株M1、M4、M7、M12、M16進行擴增引物和退火溫度的實驗探索。選用18S rRNA引物[18S-P1(5′-CCAGGCTTTACACTTTATGC-3′)和18S-P2(5′-GCGATTAAGTTGGGTAACGC-3′)]和ITS引物;選用退火溫度為56 ℃和52 ℃。通過設計3個實驗方案,方案1：引物18S-P和退火溫度56 ℃;方案2：引物18S-P和退火溫度52 ℃;方案3：引物ITS和退火溫度56 ℃。電泳結果如圖5所示,選取方案1中的M1、M4、M12、M16菌株和方案2中的M7菌株的PCR擴增產物,送往華大基因有限公司進行測序,均測序成功。

將測序結果通過BioEdit軟件進行剪切,并輸入NCBI Gen Bank數據庫進行同源性檢索,獲得近似序"列及分子生物學鑒定結果,綜合分析形態學和分子生物學鑒定結果,如表3所示。

表3 酒曲和酒醅中分離霉菌鑒定結果Table 3 Identification results of molds isolated from Xiaoqu and fermented grains

通過形態學和分子生物學鑒定,20株菌中有3株為酵母,17株為霉菌,其中霉菌屬于14個種8個屬,分別是曲霉屬、青霉屬、根霉屬、毛霉屬、共頭霉屬、橫梗霉屬、籃狀菌屬、枝孢霉屬。其中M3～M5菌株鑒定結果為酵母,但其菌落形態類似霉菌,菌落直徑較大,有菌絲蔓延現象,顯微形態中M3和M5菌株有菌絲結構,故在霉菌形態鑒定過程中,需注意毛孢子菌、白地霉等的鑒別。M6菌株顯微形態較為特殊,但結果鑒定為印度毛霉菌。

對分離的20株菌,采用系統發育樹軟件MEGA6,與GenBank數據庫中相關菌株基因序列進行系統發育分析,結果見圖6。

從系統發育進化樹看,青霉屬與曲霉屬聚在一起,根霉屬、毛霉屬、共頭霉和橫梗霉屬聚在一起,這對菌株產酶性能的研究有較大指導意義。籃狀菌屬是青霉的有性型,M19籃狀菌屬與青霉屬、曲霉屬聚在一起,符合真菌分類的規則。

2.5 菌種來源

統計霉菌的樣品來源,還原不同發酵階段的主要霉菌種類(主要霉菌的數量為1×105～1×107CFU/g),在酒曲中包括M9產黃青霉、M12橫梗霉、M14黃曲霉、M15米根霉、M16微皺籃狀菌、M18棒曲霉;在糖化過程中包括霉菌M2戴爾根霉、M6印度毛霉菌、M7微皺籃狀菌、M8爪甲曲霉、M10產黃青霉、M12橫梗霉、M15米根霉、M16微皺籃狀菌;在發酵初期(0～3 d)存在M1單孢共頭霉、M11黃曲霉、M13米曲霉、M14黃曲霉;在發酵前期(4～5 d)M14黃曲霉、M17阿姆斯特洛達姆曲霉、M18棒曲霉;發酵6 d后未篩選出霉菌。因本實驗是通過培養組學技術分離得到各個階段的霉菌種類,該結果可以表示為在該階段較為優勢霉菌種類或該階段易于培養的霉菌種類。糖化階段的霉菌主要來自于酒曲中,由于開放式的發酵環境,M6印度毛霉菌、M7微皺籃狀菌、M8爪甲曲霉可能來自于環境中,而部分霉菌未在糖化階段篩選出來,可能還未形成較優勢霉菌種類,如：M14黃曲霉和M18棒曲霉;在發酵過程中的優勢菌種主要為曲霉屬,多個曲霉屬菌種在不同的發酵階段生長成較優勢霉菌菌種,而M1單孢共頭霉、M17阿姆斯特洛達姆曲霉可能由酒糟和環境中帶入。發酵6～14 d未篩選出霉菌,說明在發酵第6天后,霉菌存在較少甚至沒有,可能是由于隨著發酵深入,酒醅中酸類物質的積累,如乙酸、乳酸等,抑制了霉菌的生長[24]。

圖6 系統發育進化樹Fig.6 Phylogenetic tree based on 18S rRNA and ITS sequences

2.6 霉菌酶活力測定

以分離得到的17株霉菌為實驗材料,制備成麩皮種,測定其蛋白酶、糖化酶、纖維素酶、果膠酶等酶活力大小,結果如表4所示。

測定霉菌的水解酶活力,有助于了解分析原料的分解利用情況。在糖化酶上,夏艷秋等[25]在黃酒中篩選出的黃曲霉高產糖化酶活力在16 196～18 352 U/(g·h),本研究中M11號黃曲霉糖化酶活力高達18 156.45 U/(g·h),其余根霉屬和曲霉屬的酶活力普遍較高,但爪甲曲霉和阿姆斯特洛達姆曲霉除外,極細枝孢霉的糖化酶活力也較高[>10 000 U/(g·h)]。在清香型小曲白酒釀造過程中通常以米根霉作為糖化發酵劑,而實驗發現黃曲霉及米曲霉表現出較高的糖化酶活力。霉菌菌株也是清香型小曲白酒釀造過程中蛋白酶的主要來源。印麗等[26]檢測茅臺鎮醬香型白酒核心產區大曲中分離霉菌的酸性蛋白酶活力在12.76～69.75 U/g,本研究中單孢共頭霉、橫梗霉和微皺藍狀菌的酸性蛋白酶活力較高(>80 U/g),其中橫梗霉在酒曲中數量較多,菌絲蔓延生長較快,有利于快速分解原料中的蛋白質等物質。在纖維素酶上,檢測的霉菌均能產纖維素酶,但酶活力均較低,多數霉菌產纖維素酶活力0.6～11.09 U/g。在產果膠酶上,僅部分霉菌產果膠酶,且酶活力均不高,僅戴爾根霉、印度毛霉菌的果膠酶酶活力較高(>36 U/g)。

表4 霉菌麩皮種的水解酶系Table 4 The hydrolytic enzymes in bran seed of mold

3 結論

為了解清香型小曲白酒釀造的主要霉菌種類及其主要特性和作用,本研究采用PDA、YPD、孟加拉紅、改良PDA和察氏培養基對酒曲和酒醅中的霉菌進行分離篩選,共計篩選得到46種菌落形態不同的疑似霉菌。進一步選擇PDA、YPD和孟加拉紅3種培養基對46株菌株進行復篩,根據在3種培養基上的菌落形態、顏色、菌落大小等因素將46株歸類為20株疑似霉菌,結合形態學及分子生物學分析,20株疑似霉菌為3株酵母,17株霉菌,其中霉菌歸為14個種8個屬,分別是曲霉屬、青霉屬、根霉屬、毛霉屬、共頭霉屬、橫梗霉屬、籃狀菌屬、枝孢霉屬。還原不同發酵階段中的主要霉菌種類,糖化階段的霉菌主要來自于酒曲中,部分霉菌可能來自于環境中;在發酵過程中的優勢菌種主要為曲霉屬,多個曲霉屬菌種在不同的發酵階段生長成較優勢霉菌菌種,少量霉菌可能由酒糟和環境中帶入。另外,對霉菌產水解酶組成及酶活力進行了解析,17株霉菌均能產生糖化酶和纖維素酶,僅部分霉菌可產生蛋白酶和果膠酶,且多數霉菌糖化酶和蛋白酶活力較高,纖維素酶和果膠酶的酶活力整體偏低。說明清香型小曲白酒生產中的霉菌類群產酶特性多樣,酶活力差異較大。本研究為后續提升清香型小曲白酒的發酵質量,提供了霉菌資源。