強化曲的制備及其在醬香型白酒中的應用

崔東琦,羅小葉,班世棟,黃武,章鈺浛,趙皓靜,王曉丹*

1(貴州大學 釀酒與食品工程學院,貴州 貴陽,550025) 2(貴州省發酵工程與生物制藥重點實驗室,貴州 貴陽,550025)

醬香型白酒釀造工藝復雜,具有“四高兩長”的特點。高溫制曲是醬香酒白酒釀造工藝中最關鍵的環節,高溫大曲中微生物的種類、數量、結構等直接決定著白酒的產量和質量。

隨著測序技術的發展,人們對酒曲和發酵過程中微生物群落結構和多樣性變化有了更深入的了解,在此基礎上,通過分離和篩選功能菌種制備強化曲,以強化酒曲性能、改善白酒品質得到廣泛關注。WANG等[1]在大曲中強化添加地衣芽胞桿菌,結果發現芳香化合物和吡嗪類物質含量顯著提高。盧君等[2]在白酒釀造過程中,利用菌種強化和工藝優化相結合的方式,將醬香型白酒基酒中四甲基吡嗪含量提高了202.75%。崔香香等[3]將分離得到的謝瓦散囊菌CICC 41584應用到濃香型白酒大曲生產中,通過固態發酵發現該菌株能夠顯著提升白酒大曲中關鍵風味成分。SU等[4]從糟醅中篩選到2株功能酵母并將其應用于小曲酒生產中,發酵結束時,酸、醇的含量分別提高了42.5%和11.8%。因此,強化曲在白酒釀造過程中具有廣闊的應用前景。

本試驗利用3株酵母菌和2株細菌分別制備強化曲,添加至六輪次生產攤晾后的糟醅中進行強化發酵,通過檢測分析酒醅理化指標和揮發性成分動態變化,探究利用功能微生物制備強化曲對固態發酵的影響,從而為利用強化曲在白酒酒質提升方面的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗菌種

試驗菌種信息如表1所示。

表1 供試菌株明細Table 1 Details of strains used in this experiment

1.2 試驗試劑和儀器

1.2.1 主要試劑

2-辛醇,德國Dr.Ehrenstorfer GmbH;鹽酸、硫酸、NaOH,分析純,重慶川東化工集團有限公司;葡萄糖、NaCl,分析純,成都金山化學試劑有限公司;次甲基藍、KH2PO4,分析純,天津科密歐化學試劑有限公司;麥芽汁肉湯培養基,MRS肉湯培養基,上海博微生物科技有限公司;瓊脂粉,北京索萊寶科技有限公司。

1.2.2 主要儀器

FA2004 N電子天平,上海菁海儀器有限公司;ZQP-75G臺式全溫振蕩培養箱,天津市萊玻特瑞儀器設備有限公司;JJ-CJ-1FD潔凈工作臺,蘇州市金凈凈化設備科技有限公司;YXQ-100A立式壓力蒸汽滅菌鍋,上海博迅實業有限公司醫療設備廠;E-201-C-9型pH計,上海鴻蓋儀器有限公司;Agilent 7890A GC-5975C MSD氣相色譜-質譜聯用儀、DB-WAX(30 m×250 μm×0.25 μm)毛細管色譜柱,美國Agilent公司;50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭,美國Supelco公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 強化曲的制備

按如下流程制備強化曲:

種子液制備：將保藏的功能菌種在麥芽汁瓊脂培養基上接種純化,酵母在30 ℃培養1 d,無菌接種到100 mL無菌麥芽汁培養基,30 ℃ 160 r/min培養24 h,制備種子液;細菌在37 ℃培養2 d,無菌接種到100 mL無菌麥芽汁培養基,37 ℃ 160 r/min培養24 h,制備種子液。

種子液擴培：稱取1 kg 麥芽糖,6 L 沸水,將麥芽糖與水按照1∶6(g∶mL)混合,攪拌均勻后,轉移至卡氏罐中,于 121 ℃ 下滅菌20 min,冷卻至室溫,加入10%(體積比),微充氧,培養2～3 d。

強化曲制備：取麩皮0.5 kg,加300 mL自來水,攪拌均勻,滅菌,曲盤滅菌,滅菌麩皮均勻分散在曲盤中,在無菌操作臺冷卻,接種細菌或酵母種子液大約100 mL,用無菌玻璃棒混合均勻,放入已經殺菌的培養箱,30 ℃培養1 d,打開培養箱門0.5～1 cm排濕,1 d后麩曲干燥,裝袋備用。

理化指標測定：麩皮和強化曲的水分、酸度、淀粉含量、氨基酸態氮、酯化力等理化指標均依據 QB/T 4257—2011《釀酒大曲通用分析方法》進行測定;酸性蛋白酶酶活測定方法參考 SB/T 10317—1999《蛋白酶活力測定法》,糖化酶酶活力測定采用DNS法[5],纖維素酶酶活測定參考趙玉萍等[6]的方法,脂肪酶酶活測定方法參考國標GB/T 23535—2009《脂肪酶制劑》。

1.3.2 固態發酵試驗

將制備好的強化曲運送至茅臺鎮某酒廠,在六輪次生產中進行固態發酵試驗。分別取攤晾后的酒醅20 kg,按m(強化曲)∶m(普通曲粉)=1∶5的比例添加強化曲和生產用曲,攪拌均勻,裝入麻袋中,封口,堆在堆子中上部進行堆積發酵,堆積發酵結束后移入窖池中上層進行窖池發酵。在堆積前、堆積后、開窖后取樣測定理化指標、揮發性風味物質。

酒醅的水分、酸度、還原糖依據 T/CBJ 004—2018 《固態發酵酒醅通用分析方法》測定,酒醅氨基酸態氮依據GB 5009.235—2016 《食品中氨基酸態氮的測定》測定。

1.3.3 樣品中揮發性風味物質的檢測

樣品預處理：準確稱取5.0 g 待檢測樣品置于20 mL頂空瓶中,加入5 μL 2-辛醇溶液(0.822 mg/mL),迅速擰緊瓶蓋密封。在45 ℃恒溫條件下,160 r/min平衡10 min。

氣相色譜-質譜檢測：樣品中揮發性物質采用氣質聯用儀檢測。色譜條件:色譜柱為DB-WAX(30 m×250 μm×0.25 μm)毛細管色譜柱;進樣口溫度為250 ℃;升溫程序：初始溫度40 ℃,以1 ℃/min 升到45 ℃,保持2 min,以3 ℃/min 升到84 ℃,保持2 min,以3 ℃/min升到120 ℃,保持3 min,以3 ℃/min 升到200 ℃,以5 ℃/min升到230 ℃,運行時間71.667 min。質譜條件：電離方式為電子電離源,離子源溫度230 ℃,電離能量70 eV,質量掃描范圍20～350 u。

各色譜峰的質譜圖結果經NIST11.L標準物質質譜圖進行比對,篩選相似度>80的物質進行定性,各揮發性風味物質成分的相對百分含量使用峰面積歸一化計算,按公式(1)計算：

(1)

式中：S組分,組分峰面積;m內標,內標物質量;S內標,內標物峰面積;m樣品,樣品質量。

2 結果與分析

2.1 強化菌產酶特性及其對麩曲理化指標的影響

實驗測定5種單菌強化曲的酸性蛋白酶、糖化酶、纖維素酶和脂肪酶活力,結果如表2 所示。5株強化菌均產糖化酶,糖化酶活力在(80.64±0.02)～(120.96±0.03) U/g,差異不顯著,這表明5種強化菌產糖化酶的能力相差不大;5種強化菌只有FBKL 1.0199產蛋白酶,活力為(26.88±0.03) U/g,這表明細菌FBKL 1.0199分解蛋白質的能力比另外4種強化菌強;產纖維素酶的強化菌有FBKL 2.0117、FBKL 1.0122、FBKL 1.0199,其中FBKL 1.0199的產纖維素酶能力最強,為(4.53±0.90) U/g,FBKL 2.0117、FBKL 1.0122的纖維素酶活力差異不顯著;產脂肪酶的強化菌有FBKL 2.00K8、FBKL 2.0117、FBKL 2.0130,三者酶活力差異不顯著,表明3種強化菌的產脂肪酶能力相近。

表2 強化曲水解酶系活力 單位:U/g

對未添加強化菌的麩皮以及5種單菌強化曲的理化指標(水分、酸度、淀粉含量、氨基酸態氮含量、酯化力)測定結果如表3所示。麩皮及5種單菌強化曲的水分含量由大到小依次為:麩皮>FBKL 2.00K8>FBKL 2.0130>FBKL 2.0117>FBKL 1.0122>FBKL 1.0199,其中強化曲FBKL 1.0199的水分含量最低,這可能與其豐富的酶系有關,FBKL 1.0199代謝產生的各種酶需要以水分為介質分解原料中的各種大分子物質,造成強化曲FBKL 1.0199的水分含量最低[7]。有研究表明,醬香大曲中的核心菌群Bacillus能夠產生蛋白酶、淀粉酶等物質,與水分呈負相關[8-9]。未添加強化菌的麩皮與5種強化曲的酸度為FBKL 1.0199>FBKL 2.00K8>FBKL 2.0117>FBKL 1.0122>麩皮>FBKL 2.0130,其中強化曲FBKL 2.0130的酸度最低,這可能因為酵母FBKL 2.0130不產蛋白酶,分解蛋白質產氨基酸能力弱,且生長代謝需要消耗大量氨基酸,造成強化曲FBKL 2.0130的酸度最低。未添加強化菌的麩皮與5種強化曲的淀粉含量為:麩皮>FBKL 2.0117>FBKL 2.0130 FBKL 1.0122>FBKL 2.00K8>FBKL 1.0199,5種強化曲的淀粉含量比地方標準 DB 52/T 872 規定偏高,這可能與5種強化曲的糖化酶活力有關,糖化酶活力越高,原料中淀粉利用率越高,強化曲的糖化酶活力低,淀粉含量偏高。有研究表明,霉菌對大曲的糖化力影響較大[10]。

酯化力、氨基酸態氮含量是反映曲粉品質的重要指標。試驗制得的5種強化曲酯化力在(52.07±0.27)～(146.73±0.23) U,酯化力反映了曲粉的產香能力;氨基酸態氮含量在(0.66±0.01)～(3.21±0.16) g/kg,這與微生物數量和代謝有著密切的關系。

表3 強化曲的理化指標Table 3 The physical and chemical indicators of fortified Daqu

本實驗 5 種強化曲由5種強化菌制備而成,因此強化曲的理化指標及酶活力存在差異。水分含量的差異反映了強化菌的生長代謝及產酶特性;酸度、氨基酸態氮含量的差異反映了強化菌的有機酸代謝能力和脂肪、蛋白質的分解能力[11],如強化菌FBKL 1.0199蛋白酶活力高,相對應酸度、氨基酸態氮含量也高。這些差異反映了不同強化菌制備的強化曲品質具有差異性。

2.2 強化曲對酒醅理化指標的影響

如圖1-a所示,堆積發酵、入窖發酵期間,空白對照組、添加FBKL 2.0117、FBKL 1.0199強化曲粉的酒醅水分含量逐漸升高,至開窖時分別為53.75%、54.96%,而添加FBKL 2.00K8、FBKL 1.0122、FBKL 2.0130強化曲粉的酒醅水分含量波動較大,至開窖時水分含量分別為51.08%、51.79%、52.50%。添加不同單菌強化曲的酒醅水分含量變化趨勢的差異,可能與微生物繁殖代謝產生與消耗水分速率不同有關。

如圖1-b所示,隨著堆積發酵、入窖發酵的進行,酒醅的酸度逐漸上升,至開窖時達到最大,添加強化曲FBKL 2.00K8、FBKL 2.0117、FBKL 1.0122、FBKL 2.0130、FBKL 1.0199的酒醅的酸度分別為4.0、3.9、4.0、4.0、4.4和4.1 mmol/(10 g),與空白對照組變化趨勢一致。

如圖1-c所示,在堆積發酵期間,還原糖含量急劇下降,入窖發酵后,還原糖含量逐漸上升,與空白對照變化趨勢一致。堆積發酵期間,酵母菌大量繁殖,生長代謝消耗還原糖,還原糖含量下降;入窖發酵后,酵母繁殖速率減慢,還原糖消耗速率減慢,且伴隨著淀粉水解生成還原糖,還原糖含量逐漸上升。

如圖1-d所示,添加強化曲FBKL 2.00K8、FBKL 2.0117、FBKL 2.0130的酒醅和空白組酒醅中氨基酸態氮含量變化趨勢相同,在堆積發酵期間,酵母大量增殖,氨基酸態氮消耗速率大,且蛋白質分解速率慢,含量有所下降;入窖發酵后,厭氧環境中酵母生長受到抑制,氨基酸態氮積累,含量升高;添加FBKL 1.0122、FBKL 1.0199的酒醅中蛋白質分解速率快,氨基酸態氮含量逐漸升高。

a-水分含量;b-酸度;c-還原糖含量;d-氨基酸態氮圖1 不同發酵階段酒醅理化指標Fig.1 Physical and chemical indicators of fermented grains at different fermentation periods注:不同字母表示同組數據在不同時期差異顯著,P<0.05

2.3 強化曲對酒醅中揮發性成分的影響

2.3.1 強化曲對酒醅中揮發性成分種類影響

通過測定不同發酵階段酒醅的揮發性成分含量,可以更好地了解微生物群落變化對釀造的影響。本文以HS-SPME-GC-MS技術,檢測堆積發酵前、堆積發酵后、開窖時酒醅中揮發性成分,酒醅中共檢測到45種揮發性成分,其中包含12種酯類物質、10種醇類物質、6種醛類物質、5種酸類物質、3種烯烴類物質、2種吡嗪類物質和7種其他類物質。

由圖2-a可知,細菌類強化曲在堆積前、堆積后、開窖時揮發性成分種類分別為41種、36種、32種,在堆積前酒醅共有的揮發性成分有19種,空白對照組酒醅中有8種特有成分,為鄰異丙基甲苯、苯甲醚、壬醛、2,3,5-三甲基吡嗪、異丁酸、5-甲基呋喃醛、丁二酸二乙酯、萜品烯,添加強化曲FBKL 1.0122的酒醅中有2種特有成分,為庚酸乙酯、1-乙基環己醇,添加強化曲FBKL 1.0199的酒醅中有6種特有成分,為丁酸乙酯、戊酸乙酯、環辛四烯、乙偶姻、乙酸苯乙酯和己酸;堆積后酒醅共有的揮發性成分有20種,空白對照組酒醅中有6種特有成分,為2,3,5-三甲基吡嗪、異丁酸、3-甲硫基丙醇、鄰苯二甲醚、丙二醇、乙偶姻,添加強化曲FBKL 1.0122的酒醅中有1種特有成分,為己酸,添加強化曲FBKL 1.0199的酒醅中有4種特有成分,為苯甲醚、1-乙基環己醇、5-甲基呋喃醛、乙酸苯乙酯;開窖時酒醅中共有的揮發性成分有21種,空白對照組酒醅中有3種特有成分,為丁酸乙酯、1-乙基環己醇、3-甲硫基丙醇,添加強化曲FBKL 1.0122的酒醅中有4種特有成分,為辛酸乙酯、己酸、乙酸苯乙酯、N-甲基-2-吡咯甲醛。

a-空白對照與細菌類強化曲揮發性成分種類差異;b-空白對照與酵母類強化曲揮發性成分解類差異圖2 不同發酵階段揮發性成分韋恩圖Fig.2 Wayne diagram of volatile components at different fermentation periods

由圖2-b可知,酵母類強化曲在堆積前、堆積后、開窖時揮發性成分種類分別為39種、35種、32種,在堆積前酒醅種共有的揮發性成分有18種,空白對照組酒醅中有3種特有成分,為鄰異丙基甲苯、苯甲醚、5-甲基呋喃醛,添加強化曲FBKL 2.00K8的酒醅中有4種特有成分,為2,3,5,6-四甲基吡嗪、己酸、3-甲基噠嗪、3-吡啶甲醇,添加強化曲FBKL 2.0117的酒醅中有3種特有成分,為丁酸乙酯、異丁醇、庚酸乙酯;堆積后酒醅中共有的揮發性成分有15種,空白對照組酒醅中有5種特有成分,為4-異丙基甲苯、乙偶姻、丙二醇、3-甲硫基丙醇、萜品烯,添加強化曲FBKL 2.00K8的酒醅中有2種特有成分,為5-甲基呋喃醛、己酸,添加強化曲FBKL 2.0117的酒醅中有2種特有成分,為鄰異丙基甲苯、1-乙基環己醇;開窖時酒醅共有的揮發性成分有20種,空白對照組酒醅中有2種特有成分,為1-乙基環己醇、3-吡啶甲醇,添加強化曲FBKL 2.00K8的酒醅中有1種特有成分,為乙偶姻,添加強化曲FBKL 2.0130的酒醅中有2種特有成分,為環辛四烯、2,3,5,6-四甲基吡嗪。

綜上所述,在發酵結束時,空白對照和添加強化曲的實驗組酒醅共有揮發性成分種類最多,空白對照和細菌類強化曲、酵母類強化曲共有的揮發性成分分別為21種、20種,添加強化曲FBKL 1.0122、FBKL 2.0130、FBKL 2.00K8的酒醅中的特有成分分別為4、2、1種。

2.3.2 強化曲對酒醅中揮發性成分含量影響

圖3 不同發酵階段酒醅中揮發性成分含量的熱圖Fig.3 The heat map of volatile components in fermented grains at different fermentation periods

通過半定量分析可以發現,在12種酯類物質中,以乙酸乙酯為主,苯乙酸乙酯、棕櫚酸乙酯次之。在10種醇類物質中,以苯乙醇、糠醇為主,苯乙醇能夠賦予白酒玫瑰花香味[12];糠醇是醬香型白酒焦香和烘焙香的關鍵來源[13]。在6種酸類物質中,主要為乙酸,其次是丁酸,乙酸可以烘托緩和白酒的主體香味,丁酸能夠賦予白酒愉悅的水果香味、增強白酒的窖香[14-15]。

對檢測到的微量成分進行熱圖繪制,并進行聚類分析。由圖3可知,堆積發酵前,揮發性成分主要有乙酸乙酯、乙酸異戊酯、戊酸乙酯、正己酸乙酯、辛酸乙酯、乙酸、糠醛、苯乙烯、苯甲醛、丁二醇、丁酸、糠醇;堆積發酵后,乙酸異戊酯、戊酸乙酯、正己酸乙酯、辛酸乙酯含量降低,乙酸、苯乙烯、苯甲醛、丁二醇、丁酸、糠醇含量增加,揮發性成分種類明顯增多,這可能與堆積發酵期間微生物大量繁殖,發生或正在進行一系列代謝反應消耗、生成各類風味成分有關;入窖發酵至結束,揮發性成分種類達到最多,主要有乙酸乙酯、丁酸乙酯、異丁醇、乙酸異戊酯、正己酸乙酯、丁二酸二乙酯、苯乙酸乙酯、棕櫚酸乙酯、苯乙醇、芐醇、糠醇、乙酸、丙酸、丁酸、糠醛、苯甲醛、2,3,5-三甲基吡嗪、2,3,5,6-四甲基吡嗪。其中,丁酸乙酯、2,3,5-三甲基吡嗪、5-甲基呋喃醛、丁二酸二乙酯在入窖發酵后,含量才逐漸增加;乙酸糠酯在堆積發酵后,含量逐漸減少;乙酸乙酯、異丁醇、正己酸乙酯、苯甲醛、丙酸、丁二醇、丁酸、糠醇、棕櫚酸乙酯、苯乙醇、芐醇含量隨著發酵的進行逐漸增加,發酵結束時含量最高。

由圖3可知,開窖時,添加產乙酸乙酯強化曲FBKL 2.00K8的酒醅中乙酸乙酯含量最高,為9.257 μg/g,相對于空白對照的6.177 μg/g,乙酸乙酯含量增長了49.9%。添加產苯乙醇強化曲FBKL 2.0117、FBKL 2.0130的酒醅中苯乙醇含量和空白對照組相差不大,分別為 2.38、2.583、2.623 μg/g。添加產吡嗪類物質強化曲FBKL 1.0122、FBKL 1.0199的酒醅中2,3,5-三甲基吡嗪含量分別為0.074、0.075 μg/g,相對于空白組的0.067 μg/g,2,3,5-三甲基吡嗪含量分別提升了11.9%、10.4%,研究表明吡嗪類物質由美拉德反應、微生物反應、蛋白質和氨基酸加熱分解等途徑產生[16],能夠賦予白酒甜香、果香以及花香[17]

3 總結

本試驗利用3株酵母菌、2株細菌制備單菌強化曲,進行固態發酵實驗并運用頂空固相微萃取-氣質聯用技術對不同發酵階段酒醅中揮發性成分進行檢測分析,共鑒定出45種揮發性成分,主要包括：酯類、醇類、醛類、酸類、吡嗪類。揮發性成分種類差異分析表明,開窖時添加強化曲FBKL 1.0122、FBKL 1.0199的酒醅和空白酒醅共有的揮發性物質有21種,添加強化曲FBKL 2.00K8、FBKL 2.0117、FBKL 2.0130的酒醅和空白酒醅共有的揮發性物質有20種。揮發性成分含量分析表明,添加強化曲 FBKL 2.00K8使酒醅中乙酸乙酯含量提升了49.9%,優于許銀等的36.6%[18];添加強化曲FBKL 1.0122、FBKL 11.0199使酒醅中2,3,5-三甲基吡嗪含量分別增長了11.9%、10.4%。

隨著“健康中國2030”規劃綱要的實施,綠色、健康已經成為未來發展趨勢,對于醬香型白酒品質要求也會提高,從大曲、酒醅中篩選功能微生物制備強化曲以提升醬香型白酒酒質具有廣闊的應用前景。本試驗以菌株FBKL 2.00K8、FBKL 1.0122、FBKL 1.0199制備強化曲,并進行固態發酵實驗,結果表明強化曲能夠提升酒醅中揮發性成分含量,為醬香型白酒酒質提升提供理論基礎。