木薯葉片多肽的制備與抗氧化功能研究

張作達,王琴飛,吳若娜,牛曉磊*,張振文*

1(海南大學 熱帶作物學院,海南 海口,570228)2(中國熱帶農業科學院 熱帶作物品種資源研究所,海南 海口,571101)

木薯(ManihotesculentaCrantz)是大戟科木薯屬植物,其葉片含有豐富的蛋白質(9.2%～12.5%,鮮重)[1],在非洲,木薯葉是人們膳食蛋白質的重要來源[2]。隨著我國特色熱帶作物產業的快速發展,農業副產物資源綜合開發利用成為研究熱點,植物源功能活性多肽產品的開發倍受關注。木薯作為我國重點發展的熱帶作物,開展木薯葉片的資源化開發利用技術研究是服務熱區、鄉村振興、推動木薯產業可持續發展和服務“一帶一路”倡議的重要舉措,具有良好的社會和經濟效益。

目前,植物源多肽的制備方法主要有酶解法、化學合成法、微生物發酵法和直接提取法,其中酶解法具有反應條件溫和,專一性較強的特點,是當前最常用的多肽制備方法[3]。活性多肽的生理功能較多,包括抗氧化、調節血脂、抗高血壓和抗腫瘤等[4],其中抗氧化是其重要的生理功能之一[5]。本研究通過優化木薯葉片的蛋白質提取方法,利用3種常用蛋白酶(堿性蛋白酶、中性蛋白酶和胰蛋白酶),對提取的木薯葉蛋白質進行酶解優化,對目標活性多肽進行初步分離和抗氧化功能驗證。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

木薯葉,品種為華南9號,中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所國家木薯種質圃;中性蛋白酶100 U/mg、堿性蛋白酶200 U/mg、胰蛋白酶250 U/mg,上海源葉生物科技有限公司;BCA試劑盒、超濾管、鐵氰化鉀、硫酸亞鐵、水楊酸和DPPH等常規試劑,海口龍華衍生生物科技中心;三水合乙酸鈉、三氯乙酸、三氯化鐵、石油醚,氫氧化鈉、鹽酸、乙腈、2,4-二硝基氟苯,海口宇圖科技有限公司。

1.2 主要儀器

電子天平、梅特勒pH計,梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;KQ-6000DE型數控超聲波清洗器,昆山市超聲儀器有限公司;數顯恒溫水浴鍋,國華(常州)儀器制造有限制造公司;酶標儀、真空冷凍干燥機,建發(廣州)有限公司;Agilent 1 260高效液相色譜儀,美國Agilent公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品脫脂

參照殷丹等[6]的脫脂方法,并加以改進。木薯葉片通過液氮研磨,并于50 mL錐形瓶中稱取1 g木薯葉片粉末,加入5 mL石油醚,用保鮮膜封口,30 ℃超聲15 min,置于150 r/min的搖床中室溫反應2 h,用1層紗布將石油醚濾出,氮吹15 min除去剩余石油醚,冷藏備用。

1.3.2 蛋白質提取

參考張燦[7]的蛋白質提取方法,并稍作修改。稱取1 g脫脂木薯葉片粉末,加入20 mL去離子水,用1 mol/L的NaOH溶液調節pH值,置于搖床中于一定溫度下反應一段時間,4 000 r/min離心20 min,取上清液。用1 mol/L的HCl溶液調pH酸沉,靜置30 min,5 000 r/min離心30 min,提取的蛋白質真空冷凍干燥后稱重。

1.3.2.1 單因素試驗

對蛋白質提取的影響因素溫度(20～60 ℃)、堿溶pH值(9.0～11.0)、酸沉pH值4.0～5.2和反應時間0.5～2.5 h進行單因素試驗,稱取1 g脫脂木薯葉片粉末,固定任意3個因素,改變另外1個因素,對蛋白質進行提取。所提取到的木薯葉片蛋白質冷凍干燥后進行稱重并計算得率。

1.3.2.2 正交試驗

以溫度、堿溶pH值、酸沉pH值和反應時間作為影響因素,設計4因素5水平的正交試驗,優化木薯葉片蛋白質提取方法,各因素水平見表1。

表1 正交設計因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal design

1.3.2.3 蛋白質純度測定

參考張妮[8]的方法,采用BCA法測定粗蛋白中的蛋白含量。蛋白質純度計算如公式(1)所示：

(1)

1.3.3 蛋白質酶解

參考李素云等[9]和肖懷秋等[10]的酶解方法,并加以改進。稱取100 mg脫脂蛋白粉,溶于20 mL去離子水中,分別加入堿性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶3種蛋白酶,加酶量為10 000 U/g,將其混合均勻,反應一定時間后,95 ℃水浴10 min滅酶,4 000 r/min離心15 min,收集上清液,以多肽濃度為考察指標,進行酶解條件的響應曲面優化。

利用Design expert 軟件,以溫度、pH值和反應時間為自變量,以多肽濃度為因變量。對中性蛋白酶、堿性蛋白酶和胰蛋白酶進行3因素3水平的響應面實驗設計,優化3種酶各自的酶解條件,因素水平見表2。

表2 三種蛋白酶酶解因素水平表Table 2 Factors and levels enzymatic hydrolysis by three proteases

1.3.4 多肽分離和多肽測定

采用超濾法對多肽混合液進行分離,選用Millipore的超濾離心管(15 mL,3 kDa),超濾離心后收集外管溶液。多肽濃度采用Biosharp的BCA試劑盒進行測定。

多肽得率測定參考王子秦[11]的方法,按公式(2)計算：

(2)

1.3.5 游離氨基酸測定

游離氨基酸的提取參考ZANG等[12]的方法并稍作修改,移取15 mL多肽溶液,用質量分數15%的三氯乙酸定容至20 mL,超聲提取30 min后,12 000 r/min離心15 min,取上清液過0.45 μm的微孔濾膜后,4 ℃保存。

以2,4-二硝基氟苯作為柱前衍生試劑,參考李艷[13]的衍生方法并稍作修改,取氨基酸混標、NaHCO3緩沖溶液與體積分數0.5%的2,4-二硝基氟苯-乙腈溶液各0.5 mL,混勻后于60 ℃水浴暗反應60 min。反應結束后避光冷卻至室溫,再加入pH值為7.0的磷酸緩沖溶液0.5 mL,靜置15 min,取10 μL進樣分析。

色譜柱：氨基酸專用色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動相A：稱取13.6 g三水合乙酸鈉,溶于1 000 mL水中,采用冰醋酸調節pH值至6.5。流動相B：V(乙腈)∶V(水)=4∶1;流速1 mL/min;檢測波長360 nm;柱溫40 ℃;進樣量10 μL。梯度洗脫程序如表3所示。

表3 梯度洗脫程序Table 3 Gradient elution procedure

1.3.6 多肽抗氧化活性評價

1.3.6.1 DPPH自由基清除活性

參考夏吉安等[14]的測定方法,并稍作修改。分別取0.2 mL不同濃度的待測樣品與等體積0.2 mmol/L DPPH-無水乙醇溶液混合均勻,常溫避光反應30 min,于517 nm處測其吸光度,記為A1;測定0.2 mL樣品與0.2 mL無水乙醇混合液的吸光度,記為A2;將0.2 mL的0.2 mmol/L DPPH溶液與0.2 mL蒸餾水的吸光度記為A3。以維生素C作為陽性對照。每組3個重復,DPPH自由基清除率按公式(3)計算：

(3)

1.3.6.2 ·OH清除活性

參考袁艷超等[15]和趙旭彤[16]的方法,并稍加改進。分別配制不同濃度的木薯葉多肽提取液,取0.2 mL的多肽提取液依次加入3 mmol/L FeSO4溶液,6 mmol/L水楊酸-乙醇溶液和6 mmol/L H2O2各0.2 mL,混勻后常溫反應30 min。反應結束后于517 nm處測定吸光值,記為A1;以去離子水代替樣品測其吸光值,記為A0。·OH清除活性按公式(4)計算：

(4)

1.3.6.3 總還原力測定

參考夏吉安等[14]和馬菲菲[17]的方法,并稍作改進。配制不同濃度的木薯葉多肽溶液,取0.2 mL樣品溶液,依次加入0.2 mL PBS緩沖液和0.2 mL質量分數1%的鐵氰化鉀溶液,50 ℃水浴反應30 min后,加入質量分數10%的三氯乙酸溶液0.2 mL,混合均勻,靜置10 min,3 000 r/min離心5 min,取0.4 mL上清液,加入0.4 mL去離子水和0.2 mL質量分數0.1%的FeCl3溶液,混勻后靜置10 min,在700 nm處測其吸光度。

1.4 數據處理

數據處理采用SPSS 20.0進行方差分析和正交分析;酶解實驗利用Design expert對數據進行響應面分析。

2 結果與分析

2.1 蛋白質提取

2.1.1 單因素試驗

由圖1-a可知,隨著堿溶pH的升高,蛋白質得率隨之增加,可能是由于堿性條件下蛋白質與水分子之間的作用增大,蛋白質的溶解性隨之升高[18];然而,據報道,當pH>11.0時,蛋白質提取率不會有顯著性增加,而且蛋白質會發生褐變[19]。在本研究中,為了避免提取的蛋白質褐變和過高的pH值導致蛋白質降解,影響蛋白質酶解效果,故選擇pH 11.0為最佳堿溶pH。從提取溫度看(圖1-b),隨著溫度的升高,蛋白質提取率呈現增加的趨勢,并在溫度60 ℃時,蛋白質提取量達到最大值。然而,溫度過高容易導致蛋白質的結構發生變化[20],影響后期蛋白質的酶解效果,故將60 ℃作為最佳提取溫度。從提取時間看(圖1-c),在2.5 h時,蛋白質提取量達到了最大值,然而提取時間在2.0、2.5 h所得蛋白質的質量差別不大,為提高效率、降低成本,選擇2.0 h為最佳提取時間。從酸沉pH看(圖1-d),隨著酸沉pH的升高,所得蛋白質的質量先增加后下降,在pH為4.6時,蛋白質提取量達到了最大值,故選擇4.6為最佳酸沉pH值。

2.1.2 正交試驗與蛋白質純度

采用正交設計對蛋白質的提取條件進行分析,方差分析結果表明(表4),溫度和堿溶pH均對蛋白質的提取量具有極顯著影響,但提取時間和酸沉pH對蛋白質提取量影響不顯著。在25組正交試驗中(表5),第7組的蛋白質提取量最高,除酸沉pH外,均與單因素試驗結果相同,因為酸沉pH對蛋白質提取量無顯著影響,綜上,蛋白質提取最佳條件為堿溶pH 11.0,溫度60 ℃,反應時間2 h,酸沉pH 4.6。所提取的蛋白質純度達到了92.57%。

a-堿溶pH;b-溫度;c-反應時間;d-酸沉pH圖1 各單因素對蛋白質提取量的影響Fig.1 Effect of single factor on protein extraction

表4 蛋白質提取正交試驗分析結果Table 4 Orthogonal test analysis results of protein extraction

表5 蛋白質提取正交試驗結果Table 5 Orthogonal test results of protein extraction

續表5

2.2 蛋白質酶解

選擇反應溫度、pH值和反應時間3個因素作為3種酶Box-Behnken實驗因素,以多肽濃度為響應值,對提取的蛋白質進行酶解。采用Design expert軟件分別對3種酶的酶解結果進行多元回歸擬合,得到的二次多項回歸模型：

中性蛋白酶：Y=6.37-0.225A-0.405B+0.290C-0.115AB-0.065AC+0.035BC-0.016A2-0.346B2-1.09C2

堿性蛋白酶：Y=6.62-0.575A-0.255B-0.278C-0.068AB-0.018AC+0.228BC-0.334A2-0.454B2-0.684C2

胰蛋白酶：Y=5.18-0.13A+0.191B+0.286C-0.083AB+0.133AC+0.035BC-0.305A2-0.282B2+0.003C2。

3個模型的方差分析結果表明(表6),回歸模型的P值均小于0.01,說明回歸模型達到了顯著水平,失擬項的P值均大于0.05,說明不顯著。中性、堿性和胰蛋白酶方差分析的復相關系數R2分別為0.988 2、0.946 4和0.952 4,校正系數R2adj分別為0.973 0、0.877 4和0.891 1,說明模型的擬合度好,可以分別解釋3種蛋白酶的酶解效果,并用于預測3種蛋白酶酶解的實際情況。

表6 回歸模型方差分析Table 6 Regression model analysis of variance

通過軟件進一步分析得到了3種酶的最適反應條件,中性蛋白酶最適酶解反應條件為：溫度35.00 ℃,pH 6.31,反應時間2.18 h;堿性蛋白酶為：溫度36.75 ℃,pH 8.76,反應時間2.44 h;胰蛋白酶為：酶解溫度36.45 ℃,pH 8.00,反應時間3.82 h。

2.3 多肽得率

由圖2可知,3種酶酶解后多肽得率在40%左右,其中胰蛋白酶酶解所得多肽得率最高,為41.89%,與堿性蛋白酶相比,多肽得率無顯著差異;中性蛋白酶酶解所得多肽得率最低,為39.57%,顯著低于其他2種酶的多肽得率。

圖2 多肽得率Fig.2 Yield of polypeptide

2.4 游離氨基酸測定

由圖3可知,氨基酸標準品有18個峰(a),其中第16個峰為衍生試劑與氨基酸反應后產生的衍生峰,其中3號峰為絲氨酸,同時衍生試劑也會在這個位置出峰,當衍生試劑被標品中的氨基酸消耗后,3號峰的絲氨酸就會顯示出來。在多肽溶液中(b),由于其游離氨基酸含量極低,因此3號峰為衍生試劑的殘留峰。在3種酶的酶解樣品中僅檢測到了極少量的酪氨酸(16號峰),質量濃度為9.90 μg/mL。

1-天冬氨酸;2-谷氨酸;3-絲氨酸;4-甘氨酸;5-組氨酸;6-精氨酸;7-蘇氨酸;8-丙氨酸;9-脯氨酸;10-酪氨酸;11-纈氨酸;12-蛋氨酸;13-半胱氨酸;14-異亮氨酸;15-亮氨酸;16-衍生峰;17-苯丙氨酸;18-賴氨酸a-氨基酸標準品;b-多肽溶液圖3 氨基酸標準品、多肽溶液衍生化后的HPLC圖譜Fig.3 HPLC chromatograms of standard and polypeptide solution after derivatization

2.5 抗氧化功能驗證

以DPPH自由基清除率、·OH清除率和總還原力為指標,來評價多肽抗氧化成分的體外抗氧化活性,以維生素C溶液作為陽性對照。由圖4可知,當酶解液的多肽質量濃度為0.35 mg/mL時,堿性蛋白酶所得多肽的DPPH自由基清除率最高,達了58.54%;但是,當多肽質量濃度高于0.35 mg/mL時,3種酶解液DPPH自由基清除率無顯著差異,中性蛋白酶所得多肽的DPPH自由基清除率略高,且在多肽質量濃度為1.5 mg/mL時,DPPH自由基清除率達到了91.83%;3種酶所得多肽的DPPH自由基清除活性與維生素C相比仍有一定差距。

圖4 DPPH自由基清除率Fig.4 DPPH free radical scavenging rate

由圖5可知,中性蛋白酶所得多肽的·OH清除活性顯著高于堿性蛋白酶和胰蛋白酶所得多肽;當中性蛋白酶所得多肽的質量濃度為1.5 mg/mL時,其·OH清除活性達到了79.32%;當維生素C質量濃度低于1.5 mg/mL時,其·OH清除活性顯著低于多肽溶液的·OH清除活性;當維生素C質量濃度達到1.5 mg/mL時,其·OH清除活性明顯升高,顯著高于多肽溶液的·OH清除活性。吸光值越高總還原力越強,由圖6可知,中性蛋白酶所得多肽的總還原力略高,在多肽質量濃度為1.5 mg/mL時,吸光度達到了0.558,但與維生素C相比,總還原力較低。綜上所述,3種酶中,中性蛋白酶所得多肽抗氧化活性最強。

圖5 ·OH清除活性Fig.5 Hydroxyl radical scavenging rate

圖6 總還原力Fig.6 Total reducing force

3 討論與結論

大部分蛋白質溶于稀鹽、稀堿和稀酸,部分與脂類相結合的蛋白質溶于乙醇等有機溶劑。本文采用堿溶酸沉法對木薯葉片中的蛋白質進行提取。呂凱波等[21]以紅花籽粕為原料,對鹽提、堿提、堿溶酸沉和超聲波輔助堿溶酸沉法進行對比,結果表明,超聲波輔助堿溶酸沉法蛋白提取率最高,堿溶酸沉法次之,蛋白質提取率僅相差4%。值得注意的是,呂凱波的研究中堿溶酸沉法的反應溫度為25 ℃,超聲輔助堿溶酸沉法的反應溫度為50 ℃。然而,本研究結果表明反應溫度對蛋白質提取率有顯著影響,因此在同等溫度下超聲輔助堿溶酸沉法不一定會比堿溶酸沉法提取率高。研究發現高溫條件下大豆分離蛋白的高溶解性是由于7S和11S之間的亞基通過二硫鍵重新結合,疏水作用力使得疏水性基團向新聚合物中間聚集,形成可溶性聚合物,因此溫度對蛋白質提取率有顯著影響[22]。

多肽的制備方法主要有酸堿水解法、酶解法、微生物發酵法、化學合成法和直接提取法。酸堿水解法會影響所得多肽的結構與功能,目前很少使用;化學合成法成本高,并且反應過程中容易產生殘留化合物;直接提取法所得多肽含量較低,難以滿足需求;酶解法和微生物發酵法反應條件溫和,是目前最常用的多肽制備方法[3];袁艷超等[15]采用混菌發酵法制備芝麻多肽,芝麻多肽的質量濃度為14.412 mg/mL時,DPPH自由基清除率達到了87.622%;馬利華等[23]在不同菌種制備大豆抗氧化肽的實驗中發現,不同菌種發酵的大豆肽DPPH自由基清除率的IC50分別為0.887、2.562、0.614 mg/mL;夏吉安等[14]的研究表明,在中性蛋白酶、堿性蛋白酶和胰蛋白酶中,由中性蛋白酶所制備的多肽DPPH自由基清除活性最高,與本文研究結果一致。

研究表明,在大多數情況下,肽段分子質量越小,其抗氧化活性越高[24]。并且研究表明N端氨基酸的疏水性與抗氧化活性呈正相關[25]。研究發現,當多肽N端為疏水性氨基酸Val或Leu時,其抗氧化活性較高[26];當Pro、Tyr和His在肽段中的位點合適時也能在一定程度上提高抗氧化活性[27-29]。芳香族氨基酸的存在也會大大提高肽段的抗氧化活性,色氨酸側鏈中的吲哚環和脯氨酸側鏈中的吡咯烷環可以通過羥基作為供氫體,從而起到抗氧化的作用[30]。因此,中性蛋白酶所得多肽抗氧化活性最高,可能是中性蛋白酶酶解過程中產生了更多N端為疏水性氨基酸的肽段,或者產生了更多含有芳香族氨基酸的肽段。因此,后期實驗中,將對分離后的多肽氨基酸進行測序,進一步研究多肽肽段大小和不同氨基酸組成對其功能活性的影響。

本研究表明,木薯葉片蛋白質最佳提取條件為：溫度60 ℃、堿溶pH 11.0、提取時間2 h,酸沉pH 4.6,其所得蛋白質的純度達到了92.57%。堿性、中性和胰蛋白酶3種酶酶解蛋白質的最佳條件分別為溫度36.74、35.00、36.45 ℃;pH值8.76、6.31、8.00;反應時間2.44、2.18、3.82 h,胰蛋白酶多肽得率最高,為41.89%。在中性蛋白酶、堿性蛋白酶和胰蛋白酶中,中性蛋白酶所得多肽的抗氧化活性最強,更適合制備木薯葉抗氧化肽。