復合生物保鮮劑的研制及其對冷卻驢肉的保鮮效果

邢智彬,吳曉彤*,劉建忠,劉靜

1(內蒙古大學 生命科學學院,內蒙古 呼和浩特,010021) 2(內蒙古蒙驢食品有限公司,內蒙古 呼和浩特,010010) 3(內蒙古商貿職業學院,內蒙古 呼和浩特,010070)

驢肉肉質細、滑、嫩,口感香、甜、正,營養全面,還有補氣養血、健腦安神、強筋通絡的保健功效[1]。驢肉銷售前處理的一種方式是冷藏,由于驢肉中不飽和脂肪酸含量較高,酶類作用和微生物的繁殖作用導致油脂氧化,使驢肉極容易出現腐敗變質現象,即使把生肉貯藏在0～4 ℃的環境中,肉類中的酶、嗜冷腐敗菌仍對肉的品質存在威脅。生物保鮮劑是通過生物分離工程直接或間接從生物中提取的具有保鮮功效的物質[2],其多為天然提取或發酵生產,高效安全,已經成為肉類保鮮技術領域的研究熱點。但幾乎沒有單一的保鮮劑可以對所有微生物既具有抑制其生長作用,又具有抑制肉類脂質氧化的效能,而利用因子間的協同作用,復合生物保鮮劑往往會產生較單一生物保鮮劑更好的保鮮效果[3]。

ALIREZALU等[4]發現蕁麻提取物制成的聚賴氨酸涂層可以有效地延長4 ℃貯藏牛肉的貨架期,而對感官品質沒有負面影響。黃明焜等[5]運用復合生物保鮮劑對冷卻牛肉進行保鮮處理,結果表明,使用22.5 g/L殼聚糖、0.15 g/L Nisin、9.7 g/L乳源抗菌肽、1.5 g/L茶多酚、3.0 g/L丁香精油時,冷卻牛肉的貨架期較空白組延長25 d以上。FANG 等[6]研究發現沒食子酸/殼聚糖可食用涂層,在4 ℃的氣調包裝中可保持新鮮豬肉的品質,并隨著沒食子酸的摻入,殼聚糖涂層的抗菌活性增強。MEHDIZADEH等[7]發現蜂膠提取物和殼聚糖制成的涂層,可使樣品中的微生物數量明顯降低(P<0.05)。相關研究發現,當殼聚糖、茶多酚和溶菌酶的質量分數分別為1%、3%、5%時,冷鮮牛肉的總揮發性鹽基氮(total volatile basic nitrogen,TVB-N)取極小值59.2 mg/kg,仍然保持比較新鮮的狀態,能夠有效地延長肉品的貨架期[8];使用質量分數0.75%的殼聚糖、1.29%的茶多酚、2.91%的溶菌酶處理冷鮮牛肉,lgCFU/g最大值為5.61,低于國家規定的6.00,達到了較好的保鮮效果[9];D-異抗壞血酸鈉常結合乳酸鏈球菌素并結合真空包裝能發揮其最佳作用,起到保鮮護色的效果,有效地延長貨架期[10]。

生物保鮮劑已經被證實具有傳統化學防腐劑的防腐、抗氧化效果。我國作為一個肉類消費大國,生物保鮮劑原料資源豐富,上游基因編輯改造技術及下游發酵和提取技術的不斷發展進步,為發展推廣綠色安全的生物保鮮劑產業提供了堅實的基礎。

為得到一種穩定性高、保鮮效果好的復合生物保鮮劑,同時延長冷卻驢肉保鮮期,保持肉質,本文以冷卻驢肉為研究對象,通過分析冷卻驢肉中的優勢菌相構成,確定抑制優勢菌相生長繁殖的保鮮成分,設計正交試驗得到復合生物保鮮劑,在第0天至第18天檢測使用復合生物保鮮劑前后冷卻驢肉相關理化指標的變化,探究復合生物保鮮劑對冷卻驢肉的保鮮效果。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

生鮮驢肉：2～3歲烏驢后腿肉,蒙驢食品有限公司;真空包裝袋,浙江喜之龍包裝有限公司;聚賴氨酸(食品級,含量≥99.8%),陜西晨明生物科技有限公司;乳酸鏈球菌素(食品級),山東巨榮生物工程有限公司;殼聚糖(食品級,脫乙酰度96%),江蘇普雷特生物工程有限公司;D-異抗壞血酸鈉(食品級),鄭州拓洋實業有限公司;戊二醛,國藥集團化學試劑有限公司;叔丁醇,天津化學試劑有限公司;平板計數瓊脂(plate count agar,PCA)培養基、結晶紫中性紅膽鹽瓊脂(violet red bile agar,VRBA)培養基、酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂(yeast peptone dextrose agar,YPD)培養基,北京陸橋技術股份有限公司;MRS培養基,北京酷來搏科技有限公司;細菌基因組DNA提取試劑盒,全式金生物科技有限公司;Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒,生工生物工程股份有限公司;引物,華大基因設計。

1.2 儀器與設備

UV-1780紫外可見分光光度計,島津儀器有限公司;Hitachi S-4800場發射掃描電子顯微鏡,日本日立高新有限公司;K9840自動凱氏定氮儀,濟南海能儀器股份有限公司;DZ-400/2L真空包裝機,諸城市恒得利食品包裝機械廠;CX21FS1C真空冷凍干燥機,北京德天佑科技發展有限公司;FD-1顯微鏡,奧林巴斯有限公司;5804R高速冷凍離心機,艾本德;PHS-3C雷磁pH計,濟南歐萊博科學儀器有限公司;TC-96/G/H(b)C基因擴增儀,杭州博日科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 復合生物保鮮劑的配制

殼聚糖溶液：根據前期實驗基礎,準確稱取殼聚糖7.5 g,加入500 mL 1%的冰醋酸后于75 ℃水浴溶解,攪拌30～40 min后靜置30 min,真空脫氣。

添加ε-聚賴氨酸、乳酸鏈球菌素、D-異抗壞血酸鈉至殼聚糖溶液中,攪拌使其均勻,真空脫氣,得到復合生物保鮮劑涂膜液。

1.3.2 原料預處理

將分割用具消毒殺菌,剔除肉表面的筋膜及多余的脂肪和結締組織,分割成200 g左右的肉塊,于0～4 ℃冷藏備用。

實驗組：冷卻驢肉涂抹正交試驗得到的復合生物保鮮劑最優濃度,室溫放置10 min后放入真空包裝袋內,于0～4 ℃冷藏,測定當天及冷藏6、12和18 d的冷卻驢肉中菌落總數、揮發性鹽基氮值、pH值,同時進行感官評價。每個樣品做3個重復。

對照組：將冷卻驢肉放入真空包裝袋內,于0～4 ℃冷藏。

1.3.3 正交試驗設計

參考文獻[10-14],根據正交試驗的設計原理,以ε-聚賴氨酸(A)、乳酸鏈球菌素(B)、D-異抗壞血酸鈉(C)為自變量,以菌落總數、揮發性鹽基氮值、pH值為響應指標,以菌落總數為主要指標,采用“綜合平衡法”,確定復合生物保鮮劑最優濃度,按表1進行正交試驗。

表1 L9(33)正交試驗表Table 1 Factors and levels L9(33) orthogonal experimental

1.3.4 數據處理

采用Excel 2010和 Origin 8.5軟件進行數據處理和作圖,每組試驗均重復3次并利用Minitab17.0軟件進行分析,P<0.05表示有統計學顯著性差異。

1.4 測定指標

1.4.1 冷卻驢肉優勢菌相分離和鑒定

取對照組冷卻驢肉在冷藏0、6、12和18 d后,挑取PCA、VRBA、YPD、MRS培養基上外觀形態不同的菌落,經純化挑取單菌落,進行革蘭氏染色,并提取基因組DNA,用通用引物27-F(AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)和1541-R(AAGGAGGTGATCCAGCCGCA)擴增16S rDNA片段[15]。用通用引物ITS1(TCCGTAGGTGAACCTGCGG)和ITS4(TCCTCCGCTTATTGATATGC)擴增18S rDNA片段[16]。委托通用生物系統有限公司測序及拼接序列后,在NCBI網站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的BLAST程序進行核酸序列的同源性比對。

1.4.2 菌落總數測定

參照GB 4789.2—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數測定》進行測定。

1.4.3 揮發性鹽基氮含量測定

參照GB/T 5009.228—2016《食品安全國家標準 食品中揮發性鹽基氮的測定》進行測定。

1.4.4 pH值測定

參照GB 5009.237—2016《食品安全國家標準 食品pH值的測定》進行測定。

1.4.5 感官評分

參考楊春婷等[17]的方法,以可接受度作為感官評價標準,取0～4 ℃冷藏的驢肉,在當天其他指標測定前取樣品測定感官評分。主要感官指標為氣味、組織狀態、持水性、色澤。評定標準如表2所示,8～10分為好;6～8分為中;4～6分為差;2分以下表明已變質。

表2 冷卻肉感官評定評分標準Table 2 Sensory evaluation standard of chilled meat

1.4.6 微觀結構的測定

參照李莎莎等[18]的方法稍作修改。將肉樣垂直肌纖維方向切成3 mm×3 mm×3 mm小塊,用質量分數為2.5%的戊二醛(pH 6.8)浸泡,過夜固定(4 ℃,24 h)。先用0.1 mol/L pH 6.8的磷酸緩沖液浸泡3次,每次10 min。然后分別使用體積分數30%、50%、70%、80%、90%、95%的乙醇脫水,每次10 min,再用無水乙醇(100%,體積分數)脫水2次,每次10 min,共3次。最后,采用氯仿進行脫脂1 h,離心。再用V(無水乙醇)∶V(叔丁醇)=3∶1、1∶1、1∶3以及叔丁醇各進行1次置換,每次為15 min。真空干燥后進行掃描電子顯微鏡觀察。

2 結果與分析

2.1 冷卻驢肉優勢菌相構成

由表3所示,對冷卻驢肉樣品中細菌測序可知優勢菌主要為：乳酸菌、考克氏菌、藤黃微球菌、腸膜明串珠菌、志賀氏桿菌、克雷伯氏菌、乳桿菌、芽胞桿菌、大腸桿菌、蜂房哈夫尼菌、河生腸桿菌、鄉間布丘菌、成團泛菌。

由表4所示,對冷卻驢肉樣品中真菌測序可知優勢菌主要為：酵母菌、霉菌。

如圖1所示,冷卻驢肉的優勢菌相以腸桿菌屬(Enterobacterium,31.06%)和酵母菌(yeasts,28.18%)為主,其次是乳酸菌屬(Lactobacillus,21.1%)、副球菌屬(Pantococcus,9.83%)、微球菌(Micrococcus,8.39%)、泛菌屬(Pandora)、霉菌(mould)。由于屠宰環境、衛生條件及運輸條件,導致腸桿菌在優勢菌相中的占比較大。腸桿菌是一種兼性厭氧菌,在真空包裝下適合其生長;而且腸桿菌對營養物質的攝取能力較強,每100 g驢肉中的蛋白質含量有22.8 g,所以腸桿菌在優勢菌相中占比最大。但本試驗未檢出許多冷卻肉中出現的假單胞菌,這可能是因為假單胞菌是一種好氧菌,在真空包裝下不易存活。

表3 冷卻驢肉樣品細菌測序結果Table 3 Bacterial sequencing results of chilled donkey meat

表4 冷卻驢肉樣品真菌測序結果Table 4 Fungus sequencing results of chilled donkey meat

圖1 冷卻驢肉優勢菌相構成Fig.1 Dominant microorganism in chilled donkey meat

選擇保鮮成分時需根據冷卻驢肉的初始優勢菌,有針對性地選擇合適的保鮮成分。相關研究表明,ε-聚賴氨酸是一種廣譜抑菌保鮮劑,對酵母菌、大腸桿菌、微球菌均具有明顯的抑制效果[19],但對乳酸菌的抑制效果不明顯,而乳酸鏈球菌素能有效抑制乳桿菌的生長繁殖,且乳酸鏈球菌素在人體消化道中可被蛋白酶水解成氨基酸,不會影響正常的腸道菌群結構[20]。殼聚糖具有較強的抗菌性、成膜性和可食性,已廣泛應用于果蔬及肉類的保鮮。D-異抗壞血酸鈉不僅可以抑制各種細菌的生長,而且是一種新型生物型食品抗氧化劑、防腐保鮮、助色劑[21]。因此實驗選用ε-聚賴氨酸、乳酸鏈球菌素、殼聚糖、D-異抗壞血酸鈉作為復合生物保鮮劑的保鮮成分。

2.2 正交試驗結果分析

采用“綜合平衡法”確定復合生物保鮮劑最優濃度,得到正交試驗直觀分析見表5,方差分析見表6。

表5 L9(33)正交試驗直觀分析表Table 5 Results of the orthogonal experiment of L9(33)

表6 方差分析表Table 6 ANOVA table

采用直觀分析法,以菌落總數為響應指標,得到最優組合A2B3C1,因素影響的主次為：B>C>A。以TVB-N值為響應指標,得到最優組合A1B1C3,因素影響的主次為：C>B>A。以pH為響應指標,得到最優組合A2B3C1,因素影響的主次為：A>B>C。實驗應用正交試驗優化了保鮮劑濃度,以菌落總數為主要指標,同時考慮其他指標,采用“綜合平衡法”,同時利用Minitab 17.0軟件分析后得到該保鮮劑的最佳濃度為：A1B2C1,即ε-聚賴氨酸質量分數為0.02%、乳酸鏈球菌素質量分數為0.06%、殼聚糖質量分數為1.5%、D-異抗壞血酸鈉質量分數為0.1%,此時保鮮效果最好,冷卻驢肉貨架期長達18 d及以上。采用此條件進行驗證實驗,檢測復合生物保鮮劑在此濃度下對冷卻驢肉保鮮效果的影響。

2.3 復合生物保鮮劑對冷卻驢肉菌落總數的影響

圖2顯示為復合生物保鮮劑對冷卻驢肉菌落總數的影響。相關國家標準中規定的冷卻肉的新鮮度與微生物菌落總數關系定為一級鮮度≤4 lg CFU/g;二級鮮度為4～6 lg CFU/g;變質肉≥6 lg CFU/g。冷卻驢肉在冷藏過程中,2組樣品的菌落總數均隨冷藏時間的延長而增長。對照組樣品的菌落總數在前6 d增長緩慢,隨冷藏時間的延長其增長速度加快,第18天時已增長至5.36 lg CFU/g。冷卻驢肉經保鮮劑處理后,其菌落總數隨冷藏時間的延長而緩慢增長,在前6 d的菌落總數數值明顯低于對照組,在第18天時,菌落總數為3.97 lg CFU/g,比對照組低1.39 lg CFU/g。

圖2 復合生物保鮮劑對冷卻驢肉菌落總數的影響Fig.2 Effect of compound biological preservative on total bacterial count of chilled donkey meat

2.4 復合生物保鮮劑對冷卻驢肉揮發性鹽基氮值的影響

TVB-N值可作為評價肉品新鮮度的指標,根據GB 2707—2016《食品安全國家標準 鮮(凍)畜、禽產品》中肉的新鮮度與揮發性鹽基氮含量關系：一級鮮肉TVB-N≤15.0 mg/100 g;二級鮮肉15.0 mg/100 g25.0 mg/100 g。如圖3所示,2組冷卻驢肉在冷藏過程中TVB-N值均呈現上升趨勢。這說明隨冷藏時間的延長,肉中的蛋白質產生的堿類物質增多,使TVB-N值增加。第0天冷卻驢肉初始TVB-N值為9.33 mg/100 g,到第18天對照組冷卻驢肉的TVB-N值為15.89 mg/100 g,經保鮮劑處理后的冷卻驢肉TVB-N值為11.45 mg/100 g,說明保鮮劑處理后的冷卻驢肉TVB-N值上升速度比對照組緩慢。對照組TVB-N值逐漸升高是由于剛屠宰的胴體本身可認為是無菌的,屠宰后受到環境中微生物的污染,隨著時間的延長,微生物數量越來越多,導致TVB-N值升高;而實驗組TVB-N值升高緩慢可能是由于動物被屠宰后,肌肉的pH值下降,同時復合生物保鮮劑對細菌的繁殖有抑制作用。試驗結果表明,經保鮮劑處理18 d后的冷卻驢肉仍在一級鮮度范圍內,說明采用復合生物保鮮劑處理冷卻驢肉能夠起到良好的保鮮效果。

圖3 復合生物保鮮劑對冷卻驢肉揮發性鹽基氮值的影響Fig.3 Effect of compound biological preservatives on volatile basic nitrogen of chilled donkey meat

2.5 復合生物保鮮劑對冷卻驢肉pH值的影響

pH值可作為評價肉品新鮮度的指標,根據GB 2707—2016《食品安全國家標準 鮮(凍)畜、禽產品》中肉的新鮮度與pH關系：一級鮮度pH 5.80～6.20;二級鮮度pH 6.30～6.60;變質肉pH>6.70。如圖4所示,在冷藏過程中,2組冷卻驢肉的pH值均呈現先下降后上升的趨勢,這可能是因為在冷卻肉貯藏的初期,因為肉品自身組織細胞還有呼吸作用,肌糖原發生無氧酵解,ATP磷酸化供能,產生了磷酸、乳酸等酸性物質,導致肉品的pH值降低[23]。之后由于微生物的作用,蛋白質、氨基酸被分解,產生胺類及含氮的堿性物質,在這些堿性物質的逐步積累下,肉的pH值開始逐漸上升,到后期微生物的含量多,使pH值增長速率有所加快,導致肉品pH值逐漸升高。第0天時冷卻驢肉初始pH值為5.88,對照組和實驗組均在第6天達到最低值,分別為5.77和5.66;到第18天時實驗組樣品的pH達到5.87,推測可能是由于殼聚糖是由冰乙酸溶液配制的,因此使得肉品的pH值較低。試驗結果表明,經復合生物保鮮劑處理18 d后的冷卻驢肉仍在一級鮮度范圍內。

圖4 復合生物保鮮劑對冷卻驢肉pH值的影響Fig.4 Effect of compound biological preservative on pH value of chilled donkey meat

2.6 復合生物保鮮劑對冷卻驢肉感官品質的影響

由圖5可知,冷卻驢肉在冷藏過程中,感官品質均呈現下降的趨勢。當冷藏時間達到第18天時,未經保鮮劑處理的冷卻驢肉感官評分為5分,此時冷卻驢肉的異味濃,肌肉在指壓后不能恢復,外表黏手,汁液流失多,肌肉無光澤呈暗紅褐色。經保鮮劑處理后的冷卻驢肉感官評分為7分,此時冷卻驢肉無異味,肌纖維紋路基本清晰。與未處理組冷卻驢肉相比,經保鮮劑處理后的冷卻驢肉感官評分下降速度緩慢,這可能是由于復合生物保鮮劑中聚賴氨酸、乳酸鏈球菌素和殼聚糖等抑菌成分抑制了肉中腐敗微生物的生長繁殖,這與菌落總數的變化相一致,同時,D-異抗壞血酸鈉保護了冷卻驢肉的顏色,對感官品質有較好的影響。

圖5 復合生物保鮮劑對冷卻驢肉感官品質的影響Fig.5 Effect of compound biological preservatives on sensory quality of chilled donkey meat

2.7 復合生物保鮮劑對冷卻驢肉肌肉微觀結構的影響

由圖6可知,未經保鮮劑處理的冷卻驢肉和經保鮮劑處理18 d后的冷卻驢肉肌肉組織基本無明顯差異,2組驢肉肌肉組織較為完整,肌纖維清晰整齊,結締組織無明顯分離。肌肉由肌纖維和結締組織膜聚集而成的肌束構成,而肌纖維是一個多核細胞,由許多平行排列的肌原纖維組成[24]。2組肌肉組織的微觀結構表明復合保鮮劑對驢肉的肌肉組織基本無改變,可以維持驢肉本身的肌肉組織特點,肌肉組織完整。

a-第0天未處理的冷卻驢肉;b-第18天保鮮劑處理的冷卻驢肉圖6 復合保鮮劑對肌肉微觀結構的影響Fig.6 Effect of compound preservative on muscle microstructure

3 結論

試驗結果表明,ε-聚賴氨酸、乳酸鏈球菌素、D-異抗壞血酸鈉和殼聚糖對冷卻驢肉中的優勢菌(乳酸菌、腸桿菌、微球菌、酵母菌)均有很好的抑制效果。得到復合生物保鮮劑中聚賴氨酸質量分數為0.02%、乳酸鏈球菌素質量分數為0.06%、殼聚糖質量分數為1.5%、D-異抗壞血酸鈉質量分數為0.1%,經復合生物保鮮劑處理后,冷卻驢肉在0～4 ℃下冷藏可達18 d及以上,有效地延長冷卻驢肉貨架期的同時,菌落總數、TVB-N、pH值較小,新鮮度較高。經掃描電鏡觀察冷卻驢肉微觀肌肉組織發現,保鮮劑處理18 d后驢肉肌肉組織仍完整。同時該復合生物保鮮劑所用原料具有天然生物無害、對環境污染少、對冷卻驢肉風味影響不大和操作易控制的優勢。