枇杷葉提取物對冷卻肉的保鮮效果

幸曉清,趙楊,司風玲*

1(重慶師范大學 生命科學學院,重慶,401331) 2(重慶市公安局高新技術產業開發區分局刑偵支隊技術大隊,重慶,401329)

冷卻肉以其獨特的風味、色澤和營養價值,已成為我國當前肉類消費的熱點[1]。冷卻肉的儲存周期長達7～14 d,但易腐敗變質,貨架期短且保水性差,而由以上原因導致的巨大經濟損失高達30億元人民幣。微生物腐敗和脂肪/蛋白質氧化是影響冷卻肉品質的主要因素,其次不飽和脂肪酸含量較高也極易發生氧化[2]。脂類在接觸空氣時極易被氧化,例如在加工肉制品時的切丁、烹調和儲存。脂類的氧化程度與豬肉的色澤、保水性和貨架期密切相關,并且決定了冷藏豬肉的感官和營養特性[3]。先前的研究發現,脂質氧化會導致肉類和肉制品產生不良的風味(酸敗)、質地變化和褐色素生成,以及有毒化合物如丙二醛(malonaldehyde,MDA)和膽固醇氧化產物的形成[3]。除了脂質氧化外,蛋白質的分解還會導致大量胺的釋放,加速肉類的腐敗。目前,最常見的保鮮方法是將豬肉冷藏在4 ℃左右,在短時間的低溫冷藏下，可以在一定程度上抑制或減少微生物(包括肉制品中的致病菌、霉菌等[4])的生長，但仍有一些耐寒細菌會繼續繁殖，進而會導致冷卻肉腐敗變質。

為避免冷卻肉腐敗變質所造成的健康威脅和經濟損失,具有清除自由基能力的抗氧化劑被用來防止肉品質的變質。低濃度的抗氧化劑可以延緩易氧化生物分子(如肉制品中的脂類和蛋白質)的氧化,從而提高產品的保質期[5]。目前,合成抗氧化劑如丁基羥基茴香醚(butylated hydroxyanisole,BHA)、丁基羥基甲苯(butylated hydroxytoluene,BHT)和山梨酸鉀(potassium sorbate,PS)等因其化學穩定性好、抗氧化活性強、成本低,常被作為保鮮劑應用于食品保鮮領域[6]。然而,越來越多的研究顯示,化合物對人體健康可能有一定危害[7],這使得天然抗氧化劑逐漸受到人們的關注與青睞。

近年來,研究者們陸續開展了含多酚類化合物的天然抗氧化劑對各類肉制品保鮮效果的研究[8-9]。研究發現,許多植物具有抗氧化活性,包括沙棘葉(Hippophaerhamnoides)[10]、槲寄生(ViscumalbumL.)[11]、櫻桃(Prunuscerasus)[12]、迷迭香(RosmarinusofficinalisL.)[13]等。植物提取物具有良好的抗氧化性及抗菌功能,這主要是由于其具有不飽和萜烯、醇類、醛類、酸類、酚類和不飽和脂肪族等生物活性物質[14]。并且,天然生物活性物質不僅具有很強的抗菌和抗氧化活性,還具有抵抗各種人類疾病的潛力[15]。總之,與合成抗氧化劑相比,天然植物抗氧化劑可能更有利于肉類保鮮。

枇杷隸屬于薔薇科枇杷屬,原產于中國中南部的寒冷山區,也常見于韓國、日本、印度的丘陵地區以及巴基斯坦的山麓地區[16]。枇杷葉已經被列入《中國藥典》(2010版),在中國和其他東亞國家中其常被用來治療感冒、咳嗽、止痰等。研究表明,枇杷葉中含有大量的黃酮類化合物和酚類物質,并且它的乙醇提取物具有較強的抗氧化活性[17]。另外,枇杷葉提取物也具有較強的抗菌能力。因此,枇杷葉提取物(Eriobotryajaponicaleaves extract,EJLE)是一種安全、健康的天然抗氧化劑。

目前,關于枇杷葉提取物對冷卻肉或其他肉制品的保鮮效果的研究較少。因此,本實驗對冷卻肉在冷藏過程中脂質氧化、微生物的數量增長等情況進行了評估,并且研究了EJLE對冷卻肉菌落總數(total plate count,APC)、pH值、過氧化值(peroxide value,POV)、硫代巴比妥酸反應產物(thiobarbituric acid reactive substance,TBARS)值、總揮發性鹽基氮(total volatile basic nitrogen,TVB-N)含量等指標的影響。

1 材料與設備

1.1 材料與試劑

新鮮豬肉(里脊肉),重慶市沙坪壩區“新世紀”超市,當天屠宰后冷藏(4 ℃)保持其鮮活狀態,并迅速運至實驗室。本研究所用枇杷葉采自重慶師范大學,用高速萬能粉碎機碾碎后過30目篩,最后儲存在密封聚乙烯袋中。

沒食子酸、2-硫代巴比妥酸、磷酸緩沖鹽水(PBS)、乙醇,生工生物工程(上海)股份有限公司;無水碳酸鈉,西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司;氯化亞鐵、甲醇,川東化工(重慶)股份有限公司;蒸餾水、超純水,密理博(Millipore)公司。

1.2 儀器與設備

FW100型高速萬能粉碎機,天津市泰斯特儀器有限公司;H01-2數顯磁力攪拌器,上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司;V1800型可見分光光度計,尤尼科(上海)儀器有限公司;S220-K梅特勒S220-K臺式酸度計離子計,梅特勒-托利多國際貿易(上海)有限公司;Eppendorf 5430 R離心機,德國艾本德股份公司;ZXFD-A5140全自動新型鼓風干燥箱,上海智城分析儀器制造有限公司;XHF-D型高速分散器,寧波新芝生物科技股份有限公司;RE-52AA上海亞榮旋轉蒸發儀,上海亞榮生化儀器廠;RaedMax—1800型可見光吸收型全波長酶標儀,上海閃譜生物科技公司。

2 實驗方法

2.1 枇杷葉提取物的制備

參照張慧蕓等[13]的方法并稍作改進,將枇杷葉粉按1∶10(g∶mL)的比例加入V(乙醇)∶V(水)=7∶3的混合物中,在4 ℃下恒溫搖床(100 r/min)24 h。接著在磁力攪拌器中攪拌15 min后用沃特曼濾紙過濾,收集濾液。使用減壓旋轉蒸發器(50 ℃)直至除去乙醇/水混合物后得EJLE產物,置于4 ℃冰箱保存備用。

2.2 樣品(豬肉)處理

將豬肉按照文獻報道的方法[18]全部切成質量不超過(10±0.2)g的小塊,隨機分為4組,每組3個重復,每個重復包括10塊豬肉。

按照FAN等[18]方法制備4種處理試劑：(1)陰性對照(不含抗氧化劑negative control,NC);(2)山梨酸鉀(PS,2 mg/g);(3)EJLE,0.5%;(4)BHA/BHT(0.01% BHA + 0.01% BHT),以上均為質量分數。將豬肉在這4種溶液中浸泡30 s后,立即取出,用半透性聚氯乙烯(polyvinyl chloride,PVC)薄膜包裹,置于4 ℃冷藏。分別在貯藏第6、9、12、15、18天時取樣測定其pH值、保水性(water holding capacity,WHC)、POV、TBARS、TVB-N和微生物含量。

2.3 含量測定

2.3.1 總酚含量

EJLE中總酚含量的測定按照文獻報道的方法[19],并做適當的修改。將0.1 mL EJLE與1 mL ddH2O混合后添加0.5 mL福林酚試劑,在混合液中加入1.5 mL 20% Na2CO3和6.9 mL ddH2O,混勻,40 ℃反應30 min。反應液于765 nm處測定吸光值。沒食子酸生成量的標準曲線為Y=0.001 7X+0.003 1,(R2=0.998)(線性范圍：60×10-6～ 1 500×10-6),總酚含量以沒食子酸當量(gallic acid equivalent,GAE)/EJLE(mg/g)表示。

2.3.2 總黃酮含量

EJLE中總黃酮含量的測定按照文獻報道的方法[19],并做適當的修改。取等量EJLE與質量濃度20 g/L AlCl3反應10 min,于415 nm處測定吸光值。按照同樣的方法,以蘆丁濃度為橫坐標,吸光值為縱坐標,獲得標準曲線方程為Y=0.021X+0.036 3,(R2=0.989)(線性范圍：25×10-6～600×10-6)。總黃酮含量用蘆丁當量(rutin equivalent,RE)/EJLE(mg/g)表示。

2.3.3 pH值和WHC

準確稱取10.0 g豬肉,加入100 mL蒸餾水(pH 7.00)進行均質處理,過濾后收集濾液,使用pH計測量每個樣品濾液的pH值。

準確稱量1 g冷藏豬肉(n=3),使用濾紙將3份豬肉分別放入1.5 mL試管中。4 ℃下13 000 r/min離心4 min。離心后置于70 ℃干燥箱中干燥12 h。稱取干燥樣品的質量,保水性按公式(1)計算:

(1)

式中：WHC,保水性,%;m0,初始樣品質量,g;m1,離心后樣品質量,g;m2,樣品干重,g。

2.3.4 POV

POV的測定參考文獻[20]所報道的方法,并做適當修改。準確稱取10 g豬肉樣品與甲醇和氯仿以1∶2∶1(g∶mL∶mL)的比例均勻混合,使用高速分散器均質2 min。分別加入90 mL氯仿和蒸餾水,接著繼續均質30 s,過沃特曼1號濾紙。1 h后收集濾液的氯仿層,減壓濃縮去除溶劑。得到的濃縮液用于POV值的測量,樣品POV值以meq/kg表示。

2.3.5 TBARS

TBARS值的測定按照文獻[21]報道的方法,并做適當的修改。準確稱取1 g絞碎均勻的豬肉樣品,分別加入5 mL 0.25 mol/L HCl、5 mL TCA質量濃度150 g/L和5 mL 質量濃度3.75 g/L TBA,混勻后呈粉紅色。將混合物在100 ℃水浴中旋轉并加熱10 min,取出冷卻后加入1 mL氯仿,5 500 r/min離心25 min。取上清液在532 nm處測定其吸光值,冷卻肉樣品的TBARS值用MDA含量表示(mg/kg)。

2.3.6 TVB-N

TVB-N含量的測定按照文獻[22]報道的方法,并做適當的修改。準確稱取2 g豬肉樣品在50 mL蒸餾水中均質化,隨后加入0.2 g MgO和1 mL 異丙醇。使用半微量蒸餾裝置進行蒸餾,0.01 mol/L HCl滴定餾出物。TVB-N含量以每100 g豬肉中含TVB-N 的毫克數表示。

2.3.7 微生物檢測

微生物檢測采取好氧APC,參照國際食品微生物規范委員會(International Committee for Microbiological Standards in Food,ICMSF)的規定[23]。準確稱取10 g豬肉樣品在90 mL 0.1%無菌蛋白胨水中均質化。對勻漿連續進行10倍稀釋,每90 mL蛋白胨水中加入1 mL勻漿。在平板計數瓊脂(傾注平板法)上進行適當的稀釋涂布,37 ℃培養箱中培養24 h后進行APC計數。

2.4 數據統計與分析

所有實驗重復3次,采用SPSS統計軟件22.0進行數據統計分析,差異顯著性采用單因素方差分析(one-way ANOVA analysis),實驗結果以平均值±標準差表示,P<0.05表示差異顯著。

3 結果與分析

3.1 EJLE總酚和總黃酮含量測定

沒食子酸標準曲線用于計算EJLE的總酚含量,約為(32.5±6.21)mg GAE/g。這與早期研究的結果一致[24],該研究表明肉桂可作為天然抗氧化劑含有大量酚類物質。蘆丁標準曲線用于計算EJLE的總黃酮含量,約為(24.6±2.99)mgRE/g。常見抗氧化劑,如棕櫚酸、9,12-十八二烯酰氯、亞麻酸等,具有較高含量的酚類化合物和黃酮類化合物,這表明EJLE也具有較高的抗氧化性。

3.2 pH值和WHC

表1顯示了用4種不同方法處理冷卻肉后,在冷藏期間其pH值的變化。結果顯示,對照組和處理組的初始pH值均高于6.18。對照組(NC)中,冷藏15 d后的pH值由(6.22±0.15)下降到(4.87±0.08),冷藏18 d后的pH值為(5.99±0.11)。pH值的降低(P<0.05)反映了豬肉中游離氨基酸因蛋白質分解而變質的程度,從而會導致NH3和胺、堿性化合物的形成[9]。隨后pH值呈上升趨勢,這與其他文獻的報道相似[25]。與對照組相比,EJLE處理后的樣品其pH值存在顯著差異。并且添加抗氧化劑對冷卻肉的pH值有一定影響(P<0.05)。

脂質氧化會促進蛋白質氧化,反之亦然[26];因此,豬肉的保水性和剪切力可能會因脂質氧化程度而變化。如表1所示,4種不同方法處理冷卻肉后,在冷藏期間其保水性差異并不顯著(65%～75%)。與測得的脂質氧化相比,蛋白質氧化程度并不高。而就目前的研究來看,脂質氧化代謝產生的自由基是促進蛋白質氧化的唯一因素[27-28]。因此,EJLE可以延緩豬肉冷藏過程中pH值的升高以及保水性的降低。

表1 EJLE、BHT/BHA、PS對冷卻肉在4 ℃貯藏過程中pH和WHC的影響Table 1 Effect of EJLE,BHT/BHA,PS on pH and WHC of chilled pork during storage at 4 ℃

3.3 抗脂肪酸氧化

POV和TBARS可以反映肉制樣品中一級氧化分解產物和二級氧化分解產物的含量。表2顯示了4種不同方法處理冷卻肉后,在冷藏期間其POVs和TBARS值的變化。冷藏第0天,POVs和TBARS值分別為0.49 ～ 0.54 meq/kg和0.020 ～ 0.025 mg/kg。冷藏第18天(儲存結束)時,POVs值為1.93～2.64 meq/kg,而TBARS值為0.604～0.932 mg/kg。POV和TBARS明顯升高代表脂質氧化程度減緩,即EJLE具有較強的抗脂質抗氧化活性。

整個貯藏期間,EJLE、BHT/BHA和PS處理后的豬肉樣品其POV值均低于NC,在第15天的大小順序為NC>PS>EJLE>BHA/BHT(P<0.05)。POV值的降低表明處理后的豬肉樣品其初級氧化產物較對照組少,這可能是由于EJLE中存在酚類、黃酮類等可以阻斷自由基鏈式反應,進而阻礙豬肉樣品的脂質氧化。由表2可知,與處理組相比,NC在貯藏第6天其TBARS值達到冷卻肉國家標準允許的最高值,即0.225 mg/kg(P<0.05)。另外,與NC相比,EJLE、BHT/BHA和PS處理后的豬肉樣品其TBARS值均有所降低(26.3%～35.2%),大小順序為NC>EJLE>PS>BHA/BHT(P<0.05)。較高的TBARS值可能是由于水活性值較低時脂質氧化有所增加所致[29]。據報道,在TBARS值大于1 mg/kg的肉制樣品中會檢測到酸味[30]。一般來說,在儲存期間,豬肉樣品的TBARS值升高(P<0.05)意味著醛不斷產生。而抗氧化劑是通過酚基提供氫來破壞自由基氧化鏈,進而終止自由基鏈式反應并形成穩定的終產物。結果與文獻中所報道的一致,合成和天然抗氧化劑對控制肉制品中的脂質氧化均有一定效應[31]。MCBRIDE等[32]發現迷迭香提取物(0.1%)在降低儲存牛肉樣品的脂質氧化方面比BHA/BHT或VE更有效。

表2 EJLE、BHT/BHA、PS對冷卻肉4 ℃貯藏過程中POV和TBARS的影響Table 2 Effect of EJLE,BHT/BHA,PS on POVs and TBARS in chilled pork during storage at 4 ℃

3.4 TVB-N

TVB-N是衡量肉或肉制品新鮮度的重要指標,它也被認為是細菌生長和蛋白質變質分解的重要指示信號[33]。FIELD等[34]研究發現食物中的酶和微生物可以將蛋白質分解成肽和氨基酸。肉制品中的蛋白質在貯藏過程中的分解對揮發性化合物的形成有很大影響,最終會導致TVB-N值升高。如表3所示,整個貯藏期間,EJLE、BHT/BHA和PS處理后的豬肉樣品其TVB-N值均有所增加。其中,NC組的TVB-N值最高(P<0.05),BHT/BHA組的TVB-N值最低。因此,與NC相比,其貨架期延長了12 d。總之,以上結果顯示出EJLE可以延緩豬肉在冷藏過程中TVB-N值的升高。

表3 EJLE、BHT/BHA、PS對冷卻肉4 ℃貯藏過程中揮發性鹽基氮的影響 單位：mg/g

3.5 抑菌試驗

如表4所示,隨著冷藏時間的延長,各組冷卻肉樣品的菌落總數均顯著增加(P<0.05)。從第6天開始，在相同的冷藏時間，EJLE處理組的微生物數量增長顯著低于BHT/BHA和PS對照組(P<0.05),主要是由于高溫下微生物的直接破壞[34]以及微生物的代謝損傷[35]。例如,BHT/BHA和PS處理組在其初期的總平板計數顯著降低(P<0.01)。冷卻肉在整個貯藏期間的微生物數量呈上升趨勢,這可能與pH值、TBARS值的增加有關。KEMP等[36]也發現微生物數量有類似的增長趨勢。有研究發現,當新鮮水牛肉中的細菌數量超過8 lg CFU/g時就會出現腐敗[37]。然而,在冷卻肉的加工和儲存過程中,其細菌數量約在2～5 lg CFU/g時就會檢測到腐敗。總之,結果表明,EJLE具有長期有效的抗菌活性。

表4 EJLE、BHT/BHA、PS對冷卻肉4 ℃貯藏過程中需氧細菌總數的影響 單位：lg CFU/g

4 結論

本實驗研究了EJLE對冷卻肉在冷藏期間品質變化的影響。結果表明,EJLE含有大量的酚類化合物,具有較強的清除自由基活性。與對照組相比,經EJLE處理后的豬肉在冷藏過程中對脂質氧化具有較強的抑制作用(P<0.05)。與BHT/BHA和PS相比,EJLE對冷卻肉的pH值、WHC、POV值和TBARS值均有一定抑制作用。但是,與其他處理組相比,合成抗氧化劑BHT/BHA和PS對冷卻肉TVB-N值的抑制效果最好。

綜合各評價指標,天然草本植物EJLE可以作為潛在的抗氧化劑,減緩冷卻肉的氧化酸敗,并且不會對感官特性產生任何有害影響。